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我读Tail-PCR 和hiTail-PCR----详解引物设计 中国海洋大学 严书林 （欢迎探讨QQ:182297146） 声明：本人生物学基础薄弱，文献也只看了四五篇，难免理解的会有偏差，写此文只代表个人观点，并没有得到刘老师审阅，接触该实验也才两个月，仅与大家交流经验之用。实际实验请以刘老师文献为准。 Tail-PCR,即热不对称性交错PCR，是一种有效的分离已知DNA序列旁侧未知区域----实现染色体步移的方法。相对于其他众多具有良好口碑的染色体步移法（如：LA-PCR， 反相PCR， 接头PCR，质粒拯救等）来说，Tail-PCR具有几大优点： 一是简单快速，不需要麻烦的酶切连接甚至是转化等操作，需要的只是DNA的提取和三轮PCR反应，一次跑胶检测和切胶回收。整个工作顺利的话两天就搞定了。而LA-PCR， 反向PCR， 接头PCR，质粒拯救都需要提取高质量的DNA，酶切，连接甚至转化筛选等不仅复杂而且质量难以控制的工作。 二是灵敏度高，整个过程只是通过PCR来完成，因而其灵敏度是相当高的。与之相反，另几种方法几乎在没有步都涉及到一个概率问题，酶切位点是否合适有个概率，连接能不能连上目的片段也是个概率，转化能不能转进去是个概率，转进去了筛选能不能刚好筛到还有个概率，几个概率相乘下来，灵敏度和成功率就很难保证了。 三是特异性高，一方面Tail-PCR设计了三条嵌套的特异性引物，从而很好的利用了槽式PCR的原理来选择特异性的产物。另一方面刘老师通过巧妙的控制了高温和低温的退火次数，来让特异性产物占优势。 四是实验稳定，重复性好。整个实验过程分为三大块：引物设计、DNA提取和PCR、产物纯化回收测序。引物设计是电脑上干的活，质量最稳定也最容易控制。干生物的DNA提取是需要闭着眼睛就能搞定的事，切胶回收测序就更不在话下了。 五是应用广泛，适合高通量分析。Tail-PCR最多的用来对插入突变中插入位点的分析，从而寻找到与谋突变表型相关的基因，就这一点来说，该方法可以对大量的突变株进行高通量分析，有利于综合的研究谋一方面的基因（如同时研究某活性物质的编码基因，正负调控基因等）。也可用于基因克隆，具体是以类似基因或者具有相同结构域的基因为参考，利用简并引物获得目的基因的部分序列，然后用Tail-PCR获得全长。 注：这里我就不讲实验的原理了，参考文献和网上已经讲的很多了，所以阅读本文之前，请确保已经阅读过： Tail-PCR:一种DNA侧翼序列分离技术/bio101/2008/21817_3.htmDNA侧翼序列分离技术---TAIL—PCR.南京林业大学学报(自然科学版) 2003,27(4):87-90 Liu Yao-Guang ,Robert F Whitter. Thermal asymmetric interlaced PCR :automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1 and YAC clones for chromosome walking[J ] . Genomics ,1995 ,25 :674 - 681.（原著，详细的讲解了如何利用不对称温度循环来控制特异产物和非特异产物的量。如果只想保证实验能做，不想深究的就不用细看了。我当时看的时候还对一个个产物的适时产量进行了严格的计算，差点吐出来，不过现在全忘了。） 我主要针对网上反映比较强烈的引物设计问题做个详细的分析，并且着重分析新的hiTail-PCR方法的传神之处。最后说几个自己对概念的理解。 Tail-PCR是指1995年刘老师设计的最初的方法，其引物主要由三条特异性引物和N条随机简并引物组成。特异性引物槽式排列，退火温度设计在58-68度，长度在20bp左右，GC%在40-60%，随机简并引物退火温度在30-48度。罗丽娟对该方法进行了综述。老的方法对于简并引物采用的人海战术，我现在看简并碱基的排列几乎就是随意设计的，没有发现有严格的依据，只是在3’端末尾保证两个碱基是非简并的。在应用中也陆续有人做了一些改动，比如提高特异性引物的退火温度，降低简并引物的退火温度，增加PCR循环中高温退火的次数，甚至是对DNA提取方法进行改进等等。 Tail-PCR整体的效果还算可以，一般都能得到旁侧序列。但是也出现了以下几个问题： 一是随机简并引物太多，一些实践案例里面，动不动就合成七八条上十条简并引物，但是最终真正出结果的就一两条，是严重的资源浪费。而且老方法采用的是对简并引物进行筛选的方法来看哪条合适，工作量也不小。如果加上对“引物池”（直译：primer pool, 即同时使用两条或多条随机引物）进行筛查就更麻烦了。很多人设计的随机引物多，搭配使用的时候甚至都用上了