第一章基因工程的分子遗传学基础分析.pptVIP

基本用途 2009-11-26 55 基因工程中常用的工具酶 工具酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚 合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于cDNA第 二链合成，双链DNA 3′末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基 * 测序酶：经修饰后消除了3’ 5’外切酶活性的T7 DNA聚合酶。 在体外反应中用含有双脱氧的核苷进行链的终止。 反转录酶：用来产生互补DNA（cDNA）；用于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可进行放射标记。 末端转移酶： 反应特点：底物：dNTP及衍生物，3个核苷酸，要求3’-OH 端，需要单链DNA作为引物，以3’-突起端的双链DNA 为最高，亦可用于双链DNA加尾。 用于3’-加尾，便于两DNA分子重组; 3’-末端标记 * 测序酶：经修饰后消除了3’ 5’外切酶活性的T7 DNA聚合酶。 在体外反应中用含有双脱氧的核苷进行链的终止。 反转录酶：用来产生互补DNA（cDNA）；用于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可进行放射标记。 末端转移酶： 反应特点：底物：dNTP及衍生物，3个核苷酸，要求3’-OH 端，需要单链DNA作为引物，以3’-突起端的双链DNA 为最高，亦可用于双链DNA加尾。 用于3’-加尾，便于两DNA分子重组; 3’-末端标记 * 第五节 研究DNA和RNA的方法 一、核酸的分离纯化 分离提取的核酸样品，分为DNA和RNA， 由于不同的实验要求，需用不同的方法进一步纯化， 核酸纯化的主要目标是 去除其中的蛋白、多糖、多酚、盐离子等杂质。 核酸的纯化、浓缩、 沉淀、定量、保存。 （一）核酸的纯化 DNA作为核酸内切酶的底物，应具备 一定的纯度， 其溶液中不能含有 酚、氯仿、乙醚、大于l0mmol/L的EDTA、 去污剂（如SDS）以及过量的盐离子浓度， 这些因素的存在均可不同程度地 影响限制性内切酶的活性。 核酸纯化的方法很多， 不同的方法对应于不同的研究目的。 酚/氯仿抽提、超速离心、 柱层析、分子杂交、 免疫沉淀、凝胶电泳等方法。 在此仅介绍从核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法。 这个方法的标准程序是 酚/氯仿（1:1）抽提1次， 氯仿抽提1-2次， 如果情况需要可再重复几次。 1、酚/氯仿抽提法的基本原理 混合使用酚、氯仿（蛋白质变性剂）， 以增加去除蛋白杂质的效果。 因为酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性； 而且酚能溶解10％-15％的水，从而能溶解一部分核酸， 同时氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。 最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的痕量酚。 如果所提核酸的酶反应条件要求极严格， 最可靠的方法是再用水饱和的乙醚 抽提一次，以彻底去除核酸样品中 的痕量酚与氯仿， 然后在68℃水浴中放置10分钟， 使痕量乙醚蒸发掉。 2. 酚/氯仿抽提法的基本步骤 如果DNA或RNA体积较小， 一般于1.5ml的Eppendorf离心管中进行， 若体积较大则于10-50ml的离心管中进行。 1）在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。 2）若DNA片段小于l0kb，可以振荡混合； 大于l0kb，则反复轻柔地转动离心管，形成乳状液。 （切勿使用高速的振荡器） 3）室温下，于10000×g以上 （一般要10000-12000 rpm以上）离心l0分钟。 4）吸取上层水相于一个新的离心管中。 如果DNA的分子量较大， 可将枪头的尖端剪去一截，以增大枪头口的直径。 吸取速