11免疫印迹技术分析.pptVIP

第11讲 免疫印迹技术 雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在印刷史上有“活化石”之称，扬州是中国雕版印刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕版印刷工艺的城市。 雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术等几种优秀的传统工艺，最终形成了这种独特文化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。 基本内容 一、免疫印迹技术的原理 通过SDS区分不同大小的蛋白组分，并转移至固相支持物（硝酸纤维素膜），通过特异性试剂（抗体）作为探针，与固相支持物上的蛋白质（抗原）发生抗原抗体反应，再通过显色反应对靶物质进行检测。 蛋白质的Western blotting技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 二、基本操作流程 二、基本操作流程 1、SDS①收集或提取蛋白样品 可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。 对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。 另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提. 二、基本操作流程 1、SDS①收集或提取蛋白样品 ②测定蛋白样品浓度 一般来说有三种方法：第一种是采用定量试剂盒；第二种是采用光学检测法；第三种直接跑SDS。 二、基本操作流程 1、SDS①收集或提取蛋白样品 ②测定蛋白样品浓度 ③电泳 配制SDS凝胶，在收集的蛋白样品中加入上样缓冲液，点样后接通电源开始电泳。 利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应将不同分子量大小的蛋白质分离。 二、基本操作流程 1、SDS①收集或提取蛋白样品 ②测定蛋白样品浓度 ③电泳 ④电泳结果检查 考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步。 同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。 二、基本操作流程 2、抗原转移 通常有两种方法：毛细管印迹法（转移效率较低）和电泳印迹法（常用）。 电泳印迹法用有空的塑料盒有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。 2、抗原转移 转移膜的选择 Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。 膜的选择根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 2、抗原转移 NC膜简介 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力强，适用于各种显色方法（包括同位素，化学发光、常规显色、染色和荧光显色），背景低，性价比高；使用也很简便（不需要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件）。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。 2、抗原转移 NC膜简介 但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。 二、基本操作流程 3、封闭 电泳转移后，固相纸膜上还留有无蛋白组分结合的区域，在对蛋白质进行专一性检测的时候，由于免疫学检测试剂中的蛋白质（抗体），在与特异性抗原结合的同时也会非特异的结合固相上的空白区域，产生高背景，导致检测结果不明显，因此要对这些空白区域进行封闭。 最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。 各种常见的封闭剂 二、基本操作流程 4、免疫检测 把已经封闭过的膜