单分子荧光共振能量转移技术详细分析.doc

研究生光谱技术与应用课程作业 河南大学 单分子荧光共振能量转移技术 学生：郭爱宇 学号：104753120870 学院：物理与电子学院 年级专业：2012级光学工程 课程名称：光谱技术及应用 指导老师：郭立俊教授 单分子荧光共振能量转移技术 摘　要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。 关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团 1 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。 2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文主要就后者做简要介绍。 2 单分子荧光共振能量转移技术（smFRET） 2.1 smFRET原理 荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团（供体，donor）的发射谱与另一种生色团（受体，acceptor）的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系， 其经典公式为E=R06/(R6+ R06)，R0为能量传递达到50%的距离。选定供、受体对之后，可将R0看作恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值就可得出E。利用R0和实验测得的E就可测得供受体间的距离R。用此方法测量生色团距离的方法被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nm之间的距离。 smFRET是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间变化推测生