细胞工程与干细胞分析.ppt

应用细胞生物学和分子生物学技术，根据人们的意愿对细胞的遗传性状进行定向改造，以获得细胞产品、药品或医用生物材料的综合技术体系。 细胞整体层次： 如细胞培养、细胞融合等； 细胞器层次： 如核移植、染色体倍性或组成改变等； 分子层次： 如基因操作技术等。 第一节 体外细胞培养 细胞培养（cell culture） 指单个细胞或细胞群在体外条件下的培养技术，可以分为原代细胞培养和传代细胞培养。 细胞系（cell line） 原代细胞经首次传代成功后的细胞 。 细胞株（cell strain） 从一个经过生物学鉴定的细胞系中用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成具有特殊性质或标志的细胞群 。 一、细胞的大规模培养 1.增加培养容积 直接向培养液中充氧。 深层全自动气升式培养缸的容量： 5升、30升、100升，1000升。 细胞凋亡是导致培养器中细胞死亡的主要原因。 在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡／死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。 “细胞静止”态可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高目的蛋白产率。 二、无血清培养 组成成分明确、质量一致、蛋白含量低； 有利于提高细胞产品生产的稳定性，并使细胞产品易于纯化； 可通过对培养基成分的优化，使不同的细胞在最有利于其生长或有利于表达目的产物的环境中持续高密度培养。 基础培养基： Ham’s-F12 、DMEM、RPMI 1640等。 附加成分促生长增殖成分： 转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、生长激素等。 促贴壁附着成分： 纤粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸 等。 第二节 细胞核移植 是指将一个双倍体的细胞核与另一个已将细胞核除去的卵细胞质重组在一起后，在一定条件下，能像受精卵一样启动发育并形成胚胎、幼体和成体的技术。 一、技术路线 卵细胞 成熟卵母细胞 (☆☆☆☆☆) 胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞都可以作为供核细胞。 重组卵需经一定时间的体外培养， 或放入中间受体动物输卵管内孵育。 家兔、猪在移植入受体子宫前约需体外培养24h。而牛、羊一般培养发育至桑椹胚期或囊胚期。 二、体细胞核移植 高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。 当供体核处于S期时，受体细胞质中高水平的MPF使染色体出现异常的几率显著升高，而当供体核处于G1或G2期时，虽然供体核同样会出现早熟凝集染色体，但对染色体没有损害。 协调供体核和去核卵母细胞的途径 1.选取处于GO或Gl期的细胞做核供体 Wilmot 血清饥饿法（0.5％）克隆羊 2.选取低MPF水平的卵母细胞做受体 1.采用人工捕获的方法 通过限制细胞培养基中的某种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段 。 2.选择G0、G1期细胞所占比例较高的细胞类型作供核细胞 刚排出的卵母细胞周围的卵丘细胞(90％以上)。 选择合适的受体细胞 肿瘤细胞 与正常细胞生理特性接近的细胞系 要有可靠的转化后筛选方法 针对细胞抗药性的筛选方法 一、物理学方法 （一）电穿孔法 采用电脉冲，简单而广泛运用于培养细胞的基因转移， 基因转移效率最高可达10－3。 （二）显微注射法 胚胎期注入目的基因，应用范围广，转基因长度可达数百kb。 （三）DNA直接注射法 最简单的基因转移方法。 如能进一步提高基因转移效率，该方法发展前景广大。 二、化学方法 （一）DEAE-葡聚糖法 对许多细胞类型的转化率极低。 （二）磷酸钙共沉淀法 转化率至少是DEAE-葡聚糖法的100倍。 （三）脂质体包埋法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层包围的囊状结构。 基因转移效率很高，据报道，最高时100％离体细胞可以瞬时表达外源基因。 三、生物学方法 该法主要指缺陷型病毒介导的基因转移。 目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛瘟病毒载体）、逆转录病毒载体(转化细胞效率高)等。 所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应； 或多或少地存在一定的安全隐患； 转导能力有限、不适于大规模生产。 习 　 题 1. 如何实现细胞的大规模培养？ 2. 无