第五章分子研究方法概述.ppt

基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名 命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 2、限制酶的特点： 二、基因载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；（质粒大于15kb时，其将外源DNA转入大肠杆菌的效率将大大降低。） 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 4）可以在载体细胞中独立复制，即本身是一个复制子。 根据载体的分子生物学特性划分 （1）.?质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制（质粒DNA载体）。如：质粒载体 （2）.?病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒。如：噬菌体载体 （3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。如：柯斯质粒载体 质粒的一般生物学特性； 质粒DNA的分离与纯化； 常用质粒载体举例； （一）.质粒plasmid ?Plasmid：质粒是细胞染色体或核区DNA外能够自主复制的很 小的环状DNA分子 。 ? ? pBR322 大肠杆菌 pSC101 ?Plasmid chromosome ? COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母质粒 ? 　环形双链质粒DNA分子具有三种不同构型： 　共价闭合环状的SC构型DNA（cccDNA），开环的OC构型DNA（oc