第五章亲和层析概述.ppt

(1) 直接测定法 ① 2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 ② 根据配体的特性进行测定 (2) 间接测定法 ① 推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ② 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。 四、特异性吸附 当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品开始进入柱中时，配体和欲分离的大分子物质间相互触，并形成复合物，当样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。 特异性吸附影响因素 配体与欲分离物质的亲和力：亲和力大时，吸附量大。 pH：随pH降低，吸附量减少。 离子强度：在相同pH条件下，离子强度降低，吸附量反而增大。 五、分离大分子物质（洗脱） 除去杂质 样品过柱后，可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤去除； 最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。 洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力决定。 亲和力较小时，可连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。 亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质(如改变pH值或离子强度)，使复合物之间的亲和力降到足以分离的程度。 亲和力较大时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白质变性剂洗脱。 六、亲和层析柱的再生 当洗脱结束后连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。 经过这样处理的柱子可以再次上样，进行第二次亲和层析。 第三节 亲和层析应用 一、纯化大分子物质 1） 抗原、抗体、抗原－抗体结合物（以金黄色葡萄球菌蛋白为配体） 2）糖蛋白 以凝集素为配体 3）核酸 PolyU-Sepharose分离mRNA PolyA-Sepharose分离与mRNA特异结合的蛋白质 二、研究酶的结构和功能 在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团。 这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以确定残留的酶活力是残留的天然酶活力?还是化学试剂作用后酶的催化能力变小了? 这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后，进行活力检测才能确定。 它们之间的分离是比较困难的。 然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。 原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的则与配体有亲和力。以此分离。 例如 实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合， 可导致酶活力丧失83％，剩余酶活力17％。 问题： 该实验的现象， 究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17％的酶活力? 还是因为有少量的核酸酶未标记上而残存酶活力? 研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。 思考题 1、什么是亲和层析？其原理是什么？ 2、亲和层析时，优良的配体应具备什么条件？ 3、亲和层析特异性吸附的影响因素有哪些？ 4、亲和层析操作洗脱时，根据亲和力大小的不同，如何选择洗脱液？ * 在进行酶的结构与功能的研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团，这种操作往往会引起酶活性的不完全丧失，但是很难界定这种不完全丧失是原酶蛋白未被化学试剂作用所致，还是由于酶活性中心受损造成的。因此，必须将有活性部位破坏的和没破坏的分开，然后分别测活。 结合的蛋白质：研究参与转录的蛋白质。 第五章 亲和层析 第一节 亲和层析基本原理 第二节 亲和层析操作 第三节 亲和层析应用 第一节 亲和层析基本原理 亲和层析定义 亲和层析是通过生物分子之间特异可逆结合与解离的原理，进行生物分子特异分离的层析技术。 在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层析技术。 20世纪70年代有了惊人的发展，并逐步得到广泛的应用。 目前，已有活化载体及其衍生物产品出售，使得亲和层析变得更简捷。 亲和层析发展过程 亲和层析优点 其他方法利用理化性质的差异，许多分子差异很小，要得到纯度高的单一分子，要联合运用多种方法