抗原抗体反应及应用概要.ppt

第七章 抗原抗体反应及应用 第1节 抗体的制备与应用 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。 多克隆抗体(PAb)：多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）：由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。 一、抗血清的制备 1、免疫动物 抗原 佐剂 免疫动物 2、抗血清的纯化与保存 采血 纯化与保存 3、抗血清的鉴定 效价 亲和力 抗原的准备 病毒、细菌、蛋白质或半抗原 半抗原与载体偶联制备完全抗原 佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化 弗氏佐剂 动物的选择 抗原与免疫动物的种属差异越远越好。 对蛋白质抗原，大部分动物皆适合，常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。 抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要量不多，选用家兔或豚鼠即可。 免疫途径 一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。 免疫剂量与周期 免疫剂量： 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/只，小动物约0.1~0.6mg/只。 免疫周期： 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫，一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物10～14天，大动物2月左右。 动物采血法 颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。 心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。 静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。 抗血清的纯化与保存 试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。 抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。 保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4℃保存。 抗血清的鉴定 效价鉴定： 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。 亲和力鉴定： 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。 抗体特异性鉴定： 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。 二、单抗的制备 1、单抗的制备原理 2、单抗的制备方法 抗原提纯和动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 筛选阳性株 单克隆抗体的制备和冻存 单克隆抗体的纯化 单抗制备的原理 MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。 为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。 单抗制备的材料 骨髓瘤细胞（经诱变和筛选）： 不产生抗体或者产生抗体的某种链但不能分泌 次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型 B细胞——小鼠或大鼠脾脏中分离得到 融合剂——50%的聚乙二醇(PEG)或电脉冲 HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的首字母缩写 )的RPMI1640(一种培养基) 单抗制备的技术 抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 HAT法筛选杂交瘤细胞 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 单克隆抗体的制备与纯化 单抗制备技术流程图 三、单抗的医学应用 单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： 单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于各类病原体的诊断，这是单克隆抗体应用最多的领域。 对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测，用于肿瘤的诊断、分型及定位。 检测淋巴细胞的表面标志，用于区分细胞亚群和细胞分化阶