细胞复苏与计数详解.pptVIP

细胞复苏 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37～40℃水浴中，快速摇晃直至完全融化（最好在1min内完成，融化时水不要浸过冻存管的盖子） 将冻存管直接离心， 1500rpm，5min； 弃上清液，加入含10%血清的培养液1ml重悬细胞，将细胞悬液接种于新的培养瓶，加入3ml新鲜的培养液，置37℃培养箱培养。 次日更换一次培养液，继续培养。 注意事项 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 冻存和复苏最好用新配制的培养液。 细胞计数 细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞数目，以调整植入的细胞 血细胞计数板是一块长方形的硬质厚玻璃板，板上有两个刻度平台，每个平台划分为9个大方格，每个大方格的面积为1平方毫米，加特制盖片（厚度0.7毫米）后的深度为0.1毫米。中心为一个大方格以双线等分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。中心大方格供红细胞计数和血小板计数用，四角的四个大方格供白细胞计数用。 取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上. 将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液(10ul)沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 将血球计数板置于显微镜的低倍镜下观察，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。 按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/ml＝四个大格子细胞数/4*104 *稀释倍数 说明： 公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。?公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：?1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 ＝1*10-4?ml? 25格*16格的血球计数板RBC计算公式 RBC数/ml=80小格RBC数/80*400*104*稀释倍数 细胞计数要点 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。??2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。?3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确。? 4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。?5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 Zseries细胞计数仪： 美国BECKMAN COULTER 20ml缓冲液+200ul样品（101倍） 操作步骤 A549细胞一瓶，将培养液去掉，加入D-Hanks3ml使液体覆盖在细胞生长面，轻轻晃动培养瓶，去液体。 加入消化液500ul，使消化液覆盖于细胞面上。(一般消化时间为1到5分钟，以镜下观察为准:细胞质回缩，胞体变圆可终止消化) 加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。 将细胞瓶中的细胞悬液移至15ml离心管中，用D-HANKS将液体总量加至5ml,混匀，吸取200ul细胞悬液置于1.5ml的EP管中用于计数。 剩下的细胞悬液以1500rpm离心5min。 去上清，根据计数的结果用新鲜培养液调整细胞悬液浓度为1*105细胞数/ml。 接种孔板 以1*103、2*103、4*103、8*103、1.6*104接种于96孔板中，每个浓度接种3个复孔，最后加3个空白对照孔（共18孔），然后每孔加入培养液200ul。 将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求） 作业 请简述一下在细胞传代、细胞冻存与复苏等细胞基本操作过程中你的体会并总结你细胞复苏的结果(如成活率，状态等）。 * *