微生物表达和调控技术方案.ppt

4. 阻遏作用与弱化作用的协调 1. 阻遏效率 启动子的转录起始频率相差70倍 2. 弱化作用 色氨酸存在时，约有10％的RNA聚合酶侥幸转录 - trp 3. 活性阻遏物 －－－－→ 无活性阻遏物 ←－－－－ +trp 5. 细菌演化出弱化系统的生物学意义 1. 通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏 2. 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA 荷载为标准进行调控更为恰当 3. 两个调控系统，避免浪费提高效率 阻遏系统 高水平trp时，不转录 低水平trp时，转录至LS 弱化系统 细调 原核生物细致的精细调控机制，增强原核生物对环境的适应性 七、转录后调控 基因表达的转录调控是生物最经济的调控方式―既然是用不着某种蛋白质，其mRNA由于用不着就不必转录。但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行微调，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。 1. 翻译起始的调控 2. 稀有密码子 3. 重叠基因 八、翻译起始的调控 遗传信息翻译成多肽链起始于而mRNA上的核糖体结合位点(RBS)。在RBS中有SD(Shine-Dalg-arno)序列，长度一般为5个核苷酸，富含 G、A，该序列与核糖体16SrRNA的3‘端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离。SD与AUG之间相距一般以4-10个核苷酸为佳，9个核苷酸最佳。SD序列的微小变化，往往会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异。这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA 5’端二级结构的自由能，影响了核糖体30 S亚基与mRNA的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。 九、稀有密码子对翻译的影响 大肠杆菌DNA复制时，冈崎片段之前的RNA引物是由dnaG基因编码的引物酶催化合成的，细胞对这种酶的需求量不大，而引物酶过多对细胞是有害的。 dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞中dnaG蛋白50个，rpoD蛋白2800个，rpsU蛋白40000个。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。 稀有密码子AUA（异亮氨酸）在高效表达的结构蛋白及σ因子中均极少使用，而在表达要求较低的dnaG蛋白中使用频率就相当高。高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。 十、重叠基因对翻译的影响 trp操纵子由5个基因(trpE、D、C、B、A)组成，在正常情况下，操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游的trpBA产量要低得多。研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核苷酸序列与翻译偶联的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密码子共用一个核苷酸。由于trpE的终止密码子与trpD的起始密码重叠，trpE翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。 1. 外源基因的起始转录： 转录起始的速率---是基因表达的限速步骤 选择可调控的启动子和相关的调控序列 诱导型 lac, trp, tac, Pr, Pl 原核启动子 组成型 T7 phage promoter 2. mRNA的延伸与稳定性：选择RNAase缺失突变株 十一、外源基因的表达 3. 外源基因mRNA的有效翻译的基本原则： 起始密码子: 首选AUG 核糖体结合位点（SD序列）:含有AGGAGG序列 起始密码与SD序列间的距离: 3--9bp mRNA的二级结构 无 终止密码子: 首选UAA 基因表达载体 相应的受体细胞 外源基因表达系统 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统 蓝细菌表达系统 单细胞、生长快，代谢易于控制，可工业化生产。 基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌