6实验五 发酵过程中糖的利用.ppt

发酵过程中糖的利用 实验目的 学习微生物生长曲线、产物形成曲线以及发酵过程中糖的利用。 (1)了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。 (2)学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。 (3)掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法。 实验原理 发酵工艺研究需要考察发酵体系中的发酵过程参数，以了解发酵进程。这些参数包括生物量（如菌体生物量、目的产物含量）、发酵环境条件（如还原糖、总糖、溶氧、pH）。 微生物生长曲线是以微生物数量为纵坐标，培养时间为横坐标画得的曲线。微生物生长曲线反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量和培养条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践具有指导意义。 测定微生物的数量方法很多，如血球计数法、平板活菌计数法、称重法、比浊法等。本实验用称重法来测定。由于真菌培养物在生长过程中，由于菌丝体的生长繁殖，导致菌体干重的增加。将菌体放在称重过的滤纸上抽滤，菌体连同滤纸一起烘干后再称重，取差值即为菌体干重。 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定(蔗糖酸水解为葡萄糖和果糖，淀粉酸水解为葡萄糖)，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在550nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 实验材料 1．实验器材 天平、超净工作台、恒温摇床、烘箱、离心机、电磁炉、恒温水浴锅。 烧杯、容量瓶、棕色试剂瓶、打孔器、三角瓶、一次性无菌注射器、0.22μm无菌过滤器、一次性无菌培养皿、无菌离心管(10mL) 2．菌种 抗菌活性菌种：F0986；靶标病原菌：终极腐霉菌株ZAU22 3．培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000 mL。 马铃薯葡萄糖琼脂（PDB）：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000 mL。在100 mL三角烧瓶中装30 mL PDB培养液，共30瓶。 4．实验试剂 （1）葡萄糖标准储备液（20mg/mL）： 称取水合葡萄糖（≥99.0%）2.22g，溶于100mL水，贮于4℃冰箱保存。使用前稀释10倍，配置成浓度为2mg/mL的标准液。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 甲溶液：称取结晶苯酚0.69g，亚硫酸氢钠0.69g，溶于1.52mL的10%氢氧化钠溶液中，稀释至6.9mL；乙溶液：称取酒石酸钾钠25.5g，溶于30mL的氢氧化钠溶液中，再加入1%的3,5-二硝基水杨酸88mL，混合均匀。将甲溶液和乙溶液混合均匀，装入棕色瓶中，贮于4℃冰箱保存。 （3）6M HCl和6M NaOH各100mL。 实验步骤 1. 供试菌接种培养和绘制生长曲线 将供试菌株在PDA培养基上活化培养，打孔器打孔后，取直径5 mm的菌饼接种在含30 mL PDB培养液的100 mL三角烧瓶中，每瓶2个菌饼，25℃静止培养1、2、3、4、5、6、7、8天（每天取出一瓶），用三层擦镜纸过滤。 取过滤后的发酵液10mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于无菌离心管中。 收集滤液 2. 发酵液还原糖测定 (1) 葡萄糖标准曲线的制定 分别吸取葡萄糖标准液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL，1.8mL，2.0mL，置于25mL容量瓶中，补水至2.0mL，再加入DNS试剂2.0mL，沸水浴中煮5min，立即冷却，用水稀释至刻度，摇匀，550nm处测定吸光值，以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 (2) 样品还原糖测定 吸取样品0.1mL，补水至2.0mL，再加入DNS试剂2.0mL，沸水浴中煮5min，立即冷却，用水稀释至刻度，摇匀，550nm处测定吸光值，根据标准曲线计算其还原糖含量。 2.总糖的测定 吸取发酵液5mL，置于25mL容量瓶中，加入0.5mL盐酸，0.5mL水，置沸水浴中煮45min，立即冷却，冷却后用氢氧化钠溶液