多花黄精皂甙的分离纯化工艺技术分析.docVIP

多花黄精皂甙的皂甙是天然植物中具有重要生物活性成分之一。据统计，有一半以上天然植物中含有皂甙。国内外对于皂甙的生物活性已有很多报道：如大豆皂甙、茶花皂甙可降血脂(Yoshikawa，2005)；轮叶党参的皂甙组分可以提高机体的免疫力(Byeon，2009)；昆诺阿藜皂甙(Kuljanabhagavad，2009) 可作为疫苗添加剂。Wang等(2001)和Cai等(2002)从湖北黄精的根茎中分离到一种薯蓣皂苷(dioscin)和一种薯蓣皂苷元(methyl protodioscin)，体外实验表明具有抗癌作用，可见皂甙具有重要而广泛的生物活性或功能。然而到目前为止关于黄精皂甙提取的工艺还鲜见报道。而纵观一些关于植物皂甙提取的方法报道中，发现绝大多数的实验材料均购自药房，这样的材料大多已经处理或炮制，不能真正反映该植物体原有的特点或生物活性物质的含量。为探讨和揭示黄精中的主要活性成分、提取方法或工艺，本研究直接从九华山挖掘黄精，对其中的主要活性物质黄精皂甙和多糖进行了连续分离提纯，摸索出一套经过优化的提取工艺，以期为开发我省黄精资源提供重要的理论基础。 1 材料与方法 1.1 原料及设备1.1.1 原料黄精地下块茎原材料于2008年8月采于安徽省九华山，经本院周守标教授鉴定为多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)。将采集来的新鲜黄精洗净，蒸馏水淋洗，晒干。使用前将黄精粉碎，过60目筛，备用。 图1 多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua.)植株(左)以及其块茎(右) Fig.1 The plant(left) and the tuber(right) of Polygonatum cyrtonema Hua.1.1.2 试剂人参皂甙RB1标准品(GINSENOSIDE-RB1 STANDARD)≥99%，型号/货号: 079-02191，购于上海贝基生物科技有限公司，产地为日本(说明：目前市场上尚没有纯化的黄精皂甙标准品出售，故以人参皂甙标准品替代)；XAD-4型大孔树脂、XAD-1180型大孔树脂购于北京慧德易科技有限公司；无水乙醇、乙醚、浓硫酸、正丁醇、香草醛、冰醋酸、甲醇、高氯酸等试剂均为分析纯。 1.1.3 仪器设备超声波清洗器(KQ2100E昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发器 (RE-52，上海青蒲 沪西仪器厂)；大容量离心机(800B，上海安亭科学仪器厂)；层析柱HL-2恒流泵(上海精密科学仪器有限公司)；BSZ-100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)、数显恒温水浴锅(HH-4，金坛市杰瑞尔电器有限公司)、电子天平(FA-N/JA-N型，上海民侨精密科学仪器有限公司)、植物粉碎机(DYF-300型, 温岭市林大机械有限公司)、干燥箱(DGX-9143BC-1，上海福玛实验设备有限公司)、721分光光度计(上海精密科学仪表有限公司)。1.2 皂甙提取 1.2.1皂甙提取的一般流程 黄 精 粉 末 乙醇浸泡 超声波提取，浓缩 乙醚脱脂，得粗皂甙 1.2.2 皂甙的提取 准确称取黄精粉末30g若干份，放入具塞圆底烧瓶，加入适量提取剂，按各种条件(料液比、时间、乙醇浓度、提取次数)进行超声提取(50℃, 频率为28 kHz)，然后抽滤。 1.2.3 脱脂 乙醇提取得到是含有脂肪的粗皂甙，采用乙醚萃取脱去粗皂甙的脂肪。将乙醚和粗皂甙提取液以一定的比例混合置于分液漏斗中，摇晃分液漏斗使乙醚与提取液混合均匀，然后放气，静置一段时间，待有明显分层后弃去下层脂肪。重复几次，直至乙醚与提取液无分层现象。 1.2.4 皂甙的纯化 1.2.4.1 饱和正丁醇萃取纯化 配制水饱和正丁醇。蒸馏水21ml，饱和正丁醇100ml(胡春风，2008)。用水饱和正丁醇纯化粗皂甙溶液。共萃取三次，待有明显分层时，弃去下层水相，收集并合并上层正丁醇部分，经旋转蒸发回收正丁醇，得到黄精皂甙的粗产品(徐丽萍，2007)。 1.2.4.2 大孔树脂纯化 (1) 大孔树脂的处理 各大孔树脂分别用70%的乙醇浸泡。将树脂分别一次性投入柱中。用70%的乙醇从树脂底部缓缓的加入，进行反洗使小颗粒树脂冲出。然后以2 BV/h 的流速正洗，洗至流出液加水不呈白色为止。用去离子水以2 BV/h 的流速洗净乙醇，再用2BV4%的HCl 溶液，以5 BV/h 的流速通过树脂层，并浸3h，再用去离子水以同样的流速洗至水洗液呈中性。最后用2.5 BV 5%的NaOH溶液，以5 BV/h 的流速通过树脂层，浸泡3h，再用去离子水以同样的流速洗至水洗液呈中性。 (2) 层析：将黄精皂甙粗产品用乙醇稀释至浓度为0.8 mg/ ml加至已经准备好的大孔树脂柱(进行吸附，先用蒸馏水进行洗脱，洗脱至流出液不显m