CHIKVNSP1蛋白表达及多克隆抗体制备实验技术分析.docx

CHIKV NSP1蛋白鼠源多克隆抗体的制备 一：实验目的 制备针对CHIKV NSP1的鼠源多克隆抗体 二：实验材料 1. pET28a-CHIKV-NSP1的Rossata菌株 2．IPTG,超声裂解液，蛋白纯化试剂等 三：实验动物 小鼠 四：实验技术路线 诱导NSP1蛋白表达，并对目的蛋白进行纯化； 将纯化后的CHIKV C蛋白免疫小鼠； 免疫后收集血清，利用western-blot检测能否与天然病毒蛋白NSP1结合； 五：实验方法 进行CHIKV- NSP1蛋白诱导表达 用5ml kan抗性LB培养基复苏Rossata菌株，37℃，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时，转接入30mlkan抗性LB培养基中。37℃，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时按终浓度为0.8mM的浓度加入IPTG进行诱导表达，16℃，220转分，诱导12小时。 配制：超声裂解液（1L） 50mM Tris（PH7.4）+150 mM NaCl+2 mM EDTA+0.1% Triton X-100 Tris-base: m=CMV=50×10-3×121.14×1=6.057g NaCl: m=CMV=150×10-3×58.44×1=8.766g EDTA: m=CMV=2×10-3×372.2×1=0.7444g Tris-base、NaCl和EDTA加入900ml ddH2O溶解后，用HCl调节PH为7.4，最后补足至1L。 将诱导后的细菌，4000转分，4℃离心15分钟，收集菌体。获得的菌体沉淀用4℃预冷的PBS（PH 7.4）洗涤3次，每次4000转分，4℃离心15分钟。洗涤后的菌体，按原始培养体积110的比例加入超声裂解液，冰浴超声破碎细胞（工作时间2秒，暂停时间5秒，功率400W，工作次数198次）。超声裂解后的菌体，12000转分，4℃离心15分钟，分别收集上清液和沉淀，加入SDS上样缓冲液处理后电泳，确定目的蛋白表达的形式（可溶性表达或者包涵体形式表达），纯化目的蛋白。 六 免疫动物制备多抗（参考动物房兔源多抗制备方案） 试验动物：小鼠，免疫前采血制备阴性血清 免疫次数：3次 免疫间隔时间：2周 免疫抗原量：每次50-100μg，体积100-200ul（不超150ul），等量加佐剂，每只小鼠每次注射总体积不超300ul 第3次免疫后两周，采血1ml分离血清，作为一抗，利用western-blot检测是否能与天然蛋白CHIKV 非结构蛋白结合。如果结合良好，即可剖杀收集血清。 七 实验结果 16℃,12h IPTG诱导质粒pET-28a(+)-CHIKV- nsp1的Rossata菌株，实验结果如下： M: Protein marker 1: Before induction by TPTG 2: After induction by IPTG 3 The supersonic lysate 4:Supernatant after supersonic lysate 5:Precipitation after supersonic lysate 采用HIS柱纯化，试验结果如下： M: Protein marker 1: Before induction by TPTG 2: After induction by IPTG 3 The supersonic lysate 4: filtrate 5: purified protein 最终获得约800μl纯化蛋白，经测定浓度为（0.703+0.773+0.712）/3 mg/ml 重新摇菌，利用AKTA层析仪进行纯化。 按照以上配方，配制Lysis/Elution buffer（Lysis低咪唑，Elution高咪唑）。 复苏后摇菌（pET-28a(+)-CHIKV- nsp1的Rossata菌株）700ml。当OD=0.62时，取诱导前菌液样品1ml留作备用。加入IPTG至终浓度为0.8mM，16℃,诱导12h ，诱导后OD=2.02,取样1ml备用跑胶。取2ml菌液分装2个EP管（每管各装1ml），4℃离心12000rpm，5min，弃上清，分别加入300ul Lysis buffer，超声裂解，工作时间3秒，暂停时间3秒，分别处理20min裂解。取其中1管，12000rpm，4℃离心，5min，分别收集上清和包涵体，包涵体加入300ul Lysis buffer重悬。每孔各加20ul，跑胶鉴定如下：nsp1部分表达于上清中。 M: Protein marker 1：诱导前 2：诱导后 3：破碎液 4：上清 5：包涵体 700ml菌液5000rpm离心10min，弃去培养基。直接用50ml Lysis buf