第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达 基因工程课件.ppt

原理： 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。 分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上； 将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK －的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰； 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。 pOK1质粒载体分离功能启动子的因素 1. 选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）； 2. 应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。 3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（ GalE+ GalT+ GalK－）作转化受体； 常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具