基因的分离与鉴定 基因工程课件.ppt

基本过程： 1. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型） 的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA; 2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。 3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离； 4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断； 5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增； 6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序； 7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。 优点： 1.可以同时比较多个样品表达的差异； 2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因； 3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来； 4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。 局限性： 1.假阳性比例高（50%～75%）； 同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差； mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针。 2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）； 应用表达