2基因表达.ppt

* * * * * 基因工程 实验技术篇 张革 中山大学药学院 zhangge@mail.susu.edu.cn 二、表 达 篇 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2．真核表达系统：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 二．原核生物基因结构和表达特点 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 T7和T5启动子： 核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸 类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （一）非融合型表达载体 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 主要元件：强启动子，SD， ATG：第一个密码子 ATG P SD TAA MCS 非融合型表达载体----pPL-Lamda PL启动子---温度诱导 插入位点--HpaI （二）融合型表达载体 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 C端融合基因 ATG TAA N端融合基因 ATG TAA 位相载体----含有3种读码框的系列载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 （1）融合型载体----pGEX系列 1.小分子量或易降解，或对宿主有毒的 目的蛋白的表达 2.GST标签纯化树脂GST Resin纯化 （2）融合型载体----His融合 1. His-Tag分子量小 ，无抗原性 2. Ni-NTA Resin (His标签纯化树脂)亲和纯化 pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。 该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对， 1.可用亲和层析(SPA)。简化下游工艺。 2.溴化氰裂解，不用酶 （3）融合型载体----IgG融合 融合表达质粒pBG-2的结构 （4）融合型载体----Trx融合 硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx） 易于可溶性表达 （三）分泌型表达载体 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 分泌型表达载体----pINIII-ompA1