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荧光实时定量PCRReal-time PCR;目录;A.定义 实时突光定量PCR(Real-time PCR)： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。 ;;如何知道基因数目的增加？;TaqMan探针法; TaqMan探针优缺点 优点：　　1、对目标序列的高特异性?????? 2、设计相对简单????? ? 3、重复性比较好 缺点：　　1、只适合一个特定的目标　　2、需委托公司标记，价格较高　　3、不易找到本底低的探针 ;SYBR Green ;SYBR Green 优点及缺点;溶解曲线;;C.; 定量原理： 理想的PCR反应：?? X=X0*2n 非理想的PCR反应：? X=X0 (1+E)n????? n：扩增反应的循环次数????? X：第n次循环后的产物量????? X0：初始模板量????? E：扩增效率 取对数 ： logX= n (1+E)+logX0 ;; logX= n (1+E)+logX0 ;;;;绝对定量;D.荧光定量PCR如何减小误差;1、校准生物学误差内参(管家基因) ; Master Mix中ROX浓度固定 ?ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关  ROX的功能：校准物理误差  –耗材质量、管盖厚度、透光性能  –反应体系监控：蒸发、操作 ;3、降低随机误差: 重复实验 ;;E.引物设计的要求： ① Tm=55-65℃ ② GC=30-80% ③ PCR扩增产物长度：在80-150bp之间 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃ 以上，15-25 个碱基 特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在;F.整体实验过程;G.基因拷贝数计算过程;基因拷贝数的计算： m M n×V MW 平均分子量（MW）MW表示 1 dalton = 1 g/mol dsDNA=（碱基数）×（660道尔顿/碱基） ssDNA=（碱基数）×（330道尔顿/碱基） ssRNA=（碱基数）×（340道尔顿/碱基） ;;实验结果要求;H.定量PCR仪主机的维护 ;1、运行背景校准 ;;纯荧光（Dye）校准 ;I.实验中可能遇到的问题及解决办法;;;3、如何保证实验一次成功 做预实验，确定标准曲线是完美的，并带一个样品，进行梯度稀释。 分析结果，确定合适的稀释倍数。然后每个样品都做普通PCR，以保证每个样品都能P出来 把有的样品P不出来，加BSA试试;4、质粒的OD260/OD280偏高对实验是否存在影响 OD260/OD280是评价DNA的纯度的，如果质粒不纯则测的OD260计算的质粒拷贝数就是不准确的。 ;