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Western blotting protocol By Wei-Zhang Wang-070610 溶液和试剂 注意：溶液的配制最好用Milli-Q或同等纯度的水!所有下面所用容器使用前都必须洗干净，并用双蒸水润洗，最后晾干。 A1. 抑制剂： 蛋白酶抑制（35mg/ml PMSF）用无水乙醇稀释为35mg/ml，室温下避光保存，可使用3－4个月。（MW：172.4g） 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂5M 氟化钠（NaF）取2.1克氟化钠置于10ml Milli-Q水中，然后vortex剧烈震荡使其充分溶解，最后分装成10μl/管，置于-20℃保存（解冻后必须1小时内使用）。 酪氨酸磷酸酶抑制剂(1M 钒酸钠（Sodium Orthovanadate）)称一定量的钒酸钠置于水中，用盐酸调pH至10.0，加热沸腾至完全溶解且溶液为无色，待溶液冷却至室温后再调pH至10.0，加热至溶液变无色，冷却后再调pH至10.0，如此反复操作至室温下pH稳定在10.0即可，最后定容至浓度为1M。此配制方法是参考网上的WB protocol，实际是否如此配制尚未实践过！ A2. 1×PBS（pH7.4） A3. 1×SDS裂解液(20ml): Stock 终浓度 Tris-HCL(pH6.8 at 25℃) 1M Tris(pH6.8) 1.25ml 62.5mM SDS 0.4g 2％(w/v) Glycerol(甘油) 2ml 10% DTT(二硫苏糖醇) 1M 1ml 50mM Bromophenol blue(溴酚蓝) 0.01%(w/v) A4. 转移缓冲液74.5g甘氨酸,15gTris碱加水定容至1000ml成5×stock，4℃保存。使用前稀释成1×：取200ml 5×stock转膜缓冲液，然后加入ddH2O，最后200ml无水甲醇至1L，4℃预冷2h以上。 A5. Tris-甘氨酸电泳buffer(pH8.3)：Tris base 15.1g 和94g甘氨酸，溶解在900ml水中，然后加入5g SDS，再加水至1000ml，成5X。 A6. 配胶所用溶液： 1）30％的凝胶储备液：Acyl 29g+Bis 1 g溶于100ml水，用滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光保存。每次使用前先放置室温15-30min。 2）1.5 mol/L Tris-HCL, pH8.8：18.16g Tris base 溶解在80ml水中，用浓盐酸调节pH值至8.8，待溶液回复到室温再用6M的盐酸调pH至8.8，最后加水至100ml，室温保存。 3）1.0 mol/L Tris-HCL, pH6.8：12.12g Tris base 溶解在80ml水中，用浓盐酸调节pH值至6.8，待溶液回复到室温再用6M的盐酸调pH至6.8，最后加水至100ml，室温保存。 4）10%SDS：称10克SDS溶于100ml水中，储存于室温。 TEMED（四甲基乙二胺）：4℃避光保存。 5）10％APS(过硫酸铵)：配制10ml,分装100-200uL至0.5ml离心管中，-20℃保存。解冻后4℃保存，不超过1周。 A7. 10×Tris Buffered Saline（TBS）： 24.2g Tris碱，80gNaCl，定容至1L，HCL调pH至7.6。 A8. 洗膜液：1×TBS中含0.1％Tween-20(0.1％TBS/T)；或者是1×PBS中含0.1％ Tween-20(0.1％PBS/T) 奶粉封闭液（30ml）30ml洗膜液（0.1％TBS/T）加入1.5g脱脂奶粉，室温下搅拌半小时以上。终浓度为1×TBS含0.1％Tween-20（0.1％TBS/T），5％脱脂奶粉（w/v）。 BSA封闭液（15ml）15ml洗膜液（0.1％TBS/T）加入0.45g BSA，颠倒混匀。终浓度1×TBS含0.1％Tween-20，3％BSA（w/v）。 以上封闭液可用1×PBS/T代替1×TBS/T。 注意：一般情况下，BSA用于多克隆抗体的封闭，脱脂奶粉用于单克隆抗体的封闭！建议第一次使用的抗体可同时用这两种方法进行封闭，以确定哪种方法的封闭效果最好。假如两种方法的效果无明显差别，必须用脱脂奶粉进行封闭（脱脂奶粉比BSA便宜很多！）。 A