实时RT-PCR1.docVIP

实时逆转录PCR 重庆医科大学医学检验系（重庆400016） 舒朝忠 罗进勇 综述 尹一兵 康格非 审校 [摘要]：实时RT-PCR是一种新技术，它利用荧光实时检测PCR反应，灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子灯塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器，即ABI Prism 7700 、Lightcycler和Biorad iCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT-PCR策略，可以将实时RT-PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因和mRNA结合变量，并可通过优化设计，实现多重RT-PCR。 关键词：逆转录PCR 定量 探针 对于检测来自有限组织标本中低含量mRNA，逆转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction ，RT-PCR)是一种敏感的方法。但是，RT-PCR在重复性和特异性方面还存在一些问题。最近发展起来的以荧光定量为基础的实时逆转录PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)，是对RT-PCR的极大改进和优化，它不仅最大限度地克服了RT-PCR的一些缺点，还具有自身突出的优点和特点。因此，其应用前景十分广阔。本综述讨论实时RT-PCR的所涉及的几个重要方面，对比常规RT-PCR和实时RT-PCR，介绍实时PCR策略，推荐几种可进行实时RT-PCR的仪器，并简介实时RT-PCR的应用。 实时RT-PCR的特点： 实时RT-PCR是将荧光技术应用于RT-PCR，即使用荧光染料或荧光标记的探针，与PCR过程中的扩增产物结合，在PCR的每一次循环中，都可观察到荧光强度的变化，这种变化对应于扩增产物量的增加，通过绘制标准曲线，最终可得到反应初期的靶基因数量。实时RT-PCR用特定的仪器将RT-PCR的扩增、检测和结果分析结合在一起，实现了真正意义上的实时绝对定量，相比于常规RT-PCR，实时RT-PCR具有以下特点： 1. 实时测定、节约时间 常规RT-PCR在PCR反应后，常需要使用凝胶电泳、DNA测序、Souther blot等方法对结果进行人工或自动化定量，这些后续步骤不仅使测定时间变长，而且在样品的传递过程中还增加了污染的机会，而实时RT-PCR不需要扩增后的这些处理就可直接对待测样本实时定量，同时，从逆转录开始到完整定量结束整个过程，都可实现自动化，这极大地节约了时间和劳动力。 2. 重复性好、测定偏差小 RT-PCR的重复性可用循环阈值来衡量，循环阈值的定义是：在实时RT-PCR过程中，连续不断地监测反映体系中荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出以99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值）时，此时的循环次数即为循环阈值。实时逆转录PCR循环阈值的变异系数在2%以下，而常规RT-PCR变异系数多在14%左右。毫无疑问实时逆转录PCR比常规RT-PCR的测定偏差明显减小。 3. 灵敏度高、特异性好 常规PCR有时为提高灵敏度，常进行需要二次扩增，但这同时也降低了特异性，增加了污染的可能性和假阳性错误。而对于实时RT-PCR，其高灵敏度不需要进行二次扩增，这将减少假阳性机率。因此，实时RT-PCR在提高反应灵敏度的同时，也保证了其特异性。 二、实时RT-PCR策略 有四种技术可应用于实时RT-PCR的定量过程中，即分子灯塔（Molecular beacons）、DNA结合染色（DNA-binding dyes）、杂交探针（Hybridization probes）和水解探针（Hydrolysis probes），他们的灵敏度都相似，其中DNA结合染色使用可特异性结合双链DNA的荧光染料，最为简便，但特异性稍差，其它三种方法则依靠荧光标记的探针与相应扩增产物的杂交实现实时测定，特异性比DNA结合染色要高 1. 分子灯塔 分子灯塔是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针[1]，其链由两部分组成，一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针的中间部分，探针形成后构成探针的环部分；另一部分是分别在5’和3’端的标记荧光物质和荧光淬灭剂，5’和3’端有几个互补的碱基存在，因而可形成两端反转配对，构成探针的茎部。在游离状态下，分子灯塔形成茎-环形式的发夹结构，使荧光剂和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭，此时茎环结构的分子灯塔不发荧光。在PCR的变性过程后，靶基因双链打开成单链，分子灯塔的茎环结构也同样被打开。探针的碱基序列如与靶基因的碱基序列完全互补，则经复性即可发生杂交。杂交的结果使探针的5’和3’端分离，淬灭剂