免疫荧光检测Reg-与PML的定位.docVIP

免疫荧光 检测Reg-(与PML的定位为例 1. 实验目的：通过免疫荧光检测Reg-(与PML是否存在共定位 2. 实验原理：细胞内的蛋白可通过特异性的抗体识别，带有荧光基团的二抗识别一抗从而放大信号，用特定的激发波长激发荧光基团可观察被检蛋白在细胞内的定位或者表达情况。不同种属来源的不同抗体可识别两个（理论上可多个）抗体，再用相应的带有不同荧光基团的二抗去识别各自的一抗，可观察到两个蛋白之间的定位情况。 3. 实验过程： （1）各实验组取20000～30000个细胞，用1640补齐各组的体积于100-200(l， 1000rpm，5min甩片，用铅笔标记各处理组。 （2）稍晾干细胞，用阻水笔画圈，圈中滴满预冷的4％的多聚甲醛，室温固定10min。 （3）预冷的PBS洗去多聚甲醛，将载玻片浸没于甲醇中，室温透化10min。 （4）预冷的PBS洗去甲醇，将载玻片放入湿盒中，2％的BSA室温封闭2h。 （5）吸去BSA，加入配制于2％的BSA中的一抗，50(l/片，放入湿盒，冷库过夜或者室温2h。 （6）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min （7）加入配制于2％的BSA中的二抗，50(l/片，放入湿盒，避光。室温孵育2h。 （8）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min，注意避光。 （9）吸去PBS，DAPI室温染色3～5min。 （10）PBS吸去游离的DAPI，加入抗淬灭剂，