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定性、定量PCR技术标准化和注意事项 上海血液学研究所 朱勇梅 定性、定量PCR操作步骤 标本采集 RNA提取 cDNA合成 巢式PCR/定量PCR 结果分析 标本采集 无菌抽取 骨髓2-4ml或外周血10ml（根据病人血象调整抽取量，以尽可能保证标本中原始细胞数量在1-2×107） EDTA抗凝 立即送检 24h内提取RNA 注意事项 由于肝素对PCR有抑制作用，因此最好用EDTA抗凝管。 如收到肝素抗凝的标本，可在细胞分层后多洗两遍，有可能去除肝素的抑制影响。 如果标本高凝不得不加肝素，送标本时请一定注明。 RNA提取 分离单个核细胞：Ficoll淋巴细胞分离液 RNA抽提：Trizol,invitrogen公司 RNA溶解：DEPC水 RNA定量：A260/A280在1.6-2.0 RNA长期保存：于RNA沉淀中加入200μL75%酒精，储存至-80℃低温冰箱。如需要再次使用RNA时，加入1/10V NaAc(3M，pH 5.2)，置于-20℃ 1小时后于12000g离心10分钟沉淀RNA，再用75%酒精洗涤二次，气干，加入DEPC水溶解。 注意事项 骨髓或血中RNA易降解，24小时内一定要提取RNA。细胞加入Trizol试剂后可以冻至-80℃低温冰箱中保存1年。 细胞与Trizol之间的比例要合适，1mL Trizol适合于提取1×107的细胞，如果加入Trizo