chapter 05 基因工程操作的主要技术.ppt

* 4-* 根据载体的不同将cDNA库分为： 质粒cDNA库: 包含的cDNA克隆数目较少，适于较高丰度的mRNA 噬菌体cDNA库:包含的cDNA克隆数目非常多，适用于那些低丰度和极低丰度的mRNA 4-* mRNA提取 cDNA合成 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 * cDNA文库的构建 4-* mRNA提取 cDNA合成 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 * cDNA文库的构建 4-* mRNA提取 cDNA合成 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 * cDNA文库的构建 ①总RNA的提取 RNA mRNA rRNA tRNA ②mRNA分离纯化（亲和层析） 4-* AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA cDNA synthesis Infect cells cDNA library 4-* 2.2 筛选cDNA库方法 ①核酸探针原位杂交筛选法； ②免疫球蛋白结合筛选法； ③用特异性引物进行PCR扩增。 4-* 4-* 凝胶阻滞电泳 DNaseI 足迹法 第七节 DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质相互作用研究 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay） 是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 凝胶阻滞电泳 4-* 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 4-* (a) (b) (c) 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 （a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。 * * * * * * * * * * 蛋白质与未标记的竞争DNA结合 凝胶电泳 放射自显影 蛋白质与标记的探针DNA结合 * * * * * * * * * * 用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的实验技术。 优点：可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。 DNaseⅠ足迹实验（footprinting assay） 4-* 1 5 10 1 4 8 10 加入蛋白质 X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A