土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定介绍.doc

微生物综合实验报告 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 及淀粉酶活力的测定 学院：生命科学学院 班级：生物技术121班 姓名： 学号： 摘要 本次实验选取广大的土壤，使用五点法采样，并制备出土壤悬液。然后将土壤悬液的上清液分四个梯度稀释，使用平板划线法反复进行分离纯化，得到纯净的菌株。我们得到菌株后，采用形态学的辨别方法，单染色，芽孢染色，革兰氏染色，淀粉水解实验，温度 实验，糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），VP试验，MR试验，吲哚试验，柠檬酸盐利用实验，耐盐性试验，硝酸盐还原实验，明胶液化试验，运动性穿刺试验，酪素水解试验，卵黄实验等方法检验，查阅伯杰氏手册后，鉴别其为蜂房芽孢杆菌。 二，材料与方法 1 材料 1.1 试剂 碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL； 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红； 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。 芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。 V.P试验：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。 硝酸盐试验：甲液（0.8g+5mol/L醋酸100mL；（-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）g 左右（每个点5g）。将土样放入无菌的纸袋中,并记录采集的时间、地点、植被类型,4 ℃保存备用。 2.2 土壤样品悬液制备 2.2.1 土壤悬液制备 各称取5 g 土壤样品于装有45ml 无菌水的100ml锥形瓶中，加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡, 制成土壤悬液。置100℃沸水浴10 min，以杀死非芽孢杆菌。静置5min。 2.2.2 土壤悬液稀释 吸取上清液0. 5 ml 加到含有49. 5 ml 无菌水的三角瓶中,配成10 - 3 g/ ml 的土壤悬液,并进一步稀释至10 - 4g/ ml 和10 - 5g/ ml。 2.3 分离纯化 2.3.1 芽孢杆菌属的纯培养 分别吸取不同稀释度的土壤悬液0. 2 ml 于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用无菌玻璃涂棒涂布均匀。每个稀释度3 个重复,37 ℃倒置培养24h。每个土样随机挑取20 个形态特征不同的单菌落,在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上划线纯化。菌落的形状、颜色、质地、透明度一致,菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致,并能产生芽孢时,确认为芽孢杆菌属的纯培养物。 单染色镜检步骤： 涂片、干燥及固定； 染色：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液或石炭酸复红液，染1 min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。 镜检：用油镜观察染色结果； 芽孢染色镜检步骤： ·取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。 ·于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。 ·用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 ·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 ·用石炭酸复红液复染l min，水洗。 ·制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。观察芽孢的形状和位置. 将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面，37℃培养18-20h。 2.3.2 产淀粉酶菌株的筛选 淀粉水解实验 对通过单染色和芽孢染色的镜检得到的纯培养的芽孢杆菌进行淀粉水解实验，并从中筛选出水解圈较大的6株菌作为目的菌，进行后续实验。具体步骤如下：挑取菌种，采用点解法接种于可溶性淀粉培养基中，每两种菌做一个平板，并做一次平行实验和空白对照组。将接种完成的平板置于37℃恒温箱中倒置培养24h。 2.3.3 菌株保藏 将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面，4℃下保存待用。 2.4初步鉴定 2.4.1形态学鉴定 将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态 、高度 、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合芽孢杆菌的指标。 革兰氏染色 经查阅伯杰氏手册，芽孢杆菌属基本为革兰氏阳性菌。由此，运用革兰氏染色技术，将不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者筛选出来，初步缩小需要检验范围。 主要步骤：先用结晶进行出染，再加媒染剂——碘液，以增加染料与细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的复合物，然后用脱色剂——乙醇进行脱色，最后用沙黄液复染，最后镜检。 2.4．2．生理生化鉴定 温度对微生物生长的影响 将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍）。使用牛肉膏蛋白胨培养基，于平板划线接种，分别在5，15，25，35，45，60，65℃条件下培养24h，观察细菌是否生长。 糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇） 取斜面培养