病毒感染细胞筛选资料.docVIP

细胞筛选? 一??嘌呤霉素? (一)?确定最优筛选浓度? 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。?1.?培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）?2.?取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105? 个/ml?的细胞悬液。? 3.?向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血 清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）? 4.?第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,?2,?4,?6,?8,?10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培 养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。）? 5.?每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(?即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一 次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。? 6.?在正常的实验操作规程时?，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大 概需3到