20-25总结与练习教案分析.docx

第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 1．掌握 印迹、探针等基本概念，PCR技术的工作原理。 2．熟悉 DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹的原理，逆转录PCR、原位PCR、实时PCR技术的基本原理，基因组DNA文库与cDNA文库的构建。 3．了解 印迹技术的应用，PCR技术的主要用途，基因芯片与蛋白质芯片原理及用途，几种生物大分子相互作用研究技术的原理及用途。 一、分子杂交与印迹技术 （一）分子杂交和印迹技术的原理 1．印迹技术( blotting) 将在凝胶中分离的生物大分子（DNA、RNA或蛋白质）转移或直接点在固相介质（常用硝酸纤维素膜）上并进行检测分析的技术。转膜的方法包括毛细作用、电转移和真空吸引转移。 2．探针技术 探针(probe)指具有特殊可检测标记、序列已知的DNA或者RNA片段，可以与待测样品中的互补序列核酸片段结合形成杂交分子。标记物常用放射性核素、生物素或荧光染料。利用标记探针可检测固相介质等样品上是否存在与其序列互补的核酸分子。 （二）印迹技术的类别及应用 1．DNA印迹(DNA blotting) DNA印迹又称Southern blotting，DNA样品经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳分离成不同大小的片段，将凝胶中的DNA变性成单链，再转移到硝酸纤维素膜或其他固相介质上。转移后通过加热或者紫外交联使DNA固定于膜上，然后用探针杂交检测。主要用于基因组DNA的定性和定量分析。 2．RNA印迹(RNA blotting) RNA印迹又称Northern blotting。基本原理与DNA印迹相同。区别在于RNA是单链分子，样品经变性琼脂糖凝胶电泳分离，电泳前不需要限制酶消化，转膜前也不用变性。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可比较不同组织或细胞中同一基因的表达情况。 3．蛋白质印迹 蛋白质印迹又称免疫印迹( immunoblotting)或Western blotting。蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离成不同大小的条带，再以电转移方式转到硝酸纤维素膜或其他固相介质上。核酸探针只能用来检测核酸，蛋白质则需要由抗体来检测。第一抗体首先与特定蛋白质结合，再用酶或者放射性核素标记的第二抗体来结合第一抗体，最后根据标记物类型采用显色反应或者放射自显影的方式检测信号。蛋白质印迹技术用于检验样品中特异性蛋白 质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究。 除上述3种基本印迹技术外，其他印迹技术还有斑点印迹、原位杂交、DNA芯片技术等。 二、PCR技术的原理和应用 （一）PCR技术的工作原理 1．PCR技术 即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，是在体外将微量目的DNA片段大量扩增的技术。其原理为：以含有拟扩增序列的DNA分子为模板，反应体系中加入与拟扩增序列两端互补的特异寡核苷酸片段为引物，在耐热DNA聚合酶的作用下以四种dNTP为原料，按照半保留机制沿模板链延伸合成新的DNA，多次重复这一过程，目的DNA片段即被扩增。 2．PCR反应步骤 PCR的基本反应步骤包括： (l)变性将反应体系加热到95℃，使模板DNA完全变性为单链，引物间双链也被解开。 (2)退火将温度下降到适宜温度（一般较Tm低5℃）使引物与模板DNA结合。 (3)延伸 将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA合成。 上述3个步骤称为1个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环(25～30次)后即达到扩增DNA片段的目的。 （二）PCR技术的主要用途 1．目的基因的克隆。 2．基因的体外突变。 3．DNA和RNA的微量分析。 4．DNA序列测定。 5．基因突变分析。 （三）几种重要的PCR衍生技术 1．逆转录PCR技术(reverse transcription PCR，RT- PCR) 是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。 2．原位PCR技术(in situ PCR) 在甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 3．实时PCR技术(real- time PCR) 实时PCR技术又称定量PCR(quantitative PCR)或实时定量PCR( real-time quantitative PCR)，是一种准确检测样品中特定DNA或cDNA含