实验-精子细胞学06-4-6.pptVIP

精子细胞学分析 精液基本分析 标本采集和转运 标本安全处理 初步肉眼观察 液化、外观、体积、粘稠度、pH值 显微镜初检 密度、活力、非精子细胞成分、精子凝集 低渗膨胀实验（HOS) 原理：基于完整细胞膜半渗透性简单实验，其引起低渗状态下的精子膨胀，即当有水流入时细胞体积膨胀。 试剂：配制取伊红Y 5g溶于蒸馏水100ml中，浓度为5%。 方法：取新鲜精液一滴加伊红Y溶液一滴，于玻片上混合染色lmin后光镜检。 器材：载玻片 盖玻片 加样枪及枪头 显微镜 计数器 试管架。 药品：伊红Y 、 蒸馏水。 结果分析： 精子尾部肿胀率=尾部肿胀数/精子计数的总数 精液标本中有60%以上的精子出现尾部肿胀，则认为HOS实验正常。如果尾部肿胀精子数低于50%，该精液标本则被认为异常。 精子存活率 染色原理： 精子存活率是采用染料对精子进行染色，根据精子是否着色判断精子的死活。一般精子死亡后，细胞通透性改变，易于着色。 染料通过精子受损细胞膜将精子染成红色，而结构完整的精子则不着色。 试剂配制： 取伊红Y 5g溶于等渗生理盐水100ml中即可。 染色方法： 取新鲜精液一滴加伊红Y溶液一滴，于玻片上混合染色lmin后光镜检查，死精子呈红色，活精子不着色，计数200个精子，得出活精子百分数。 器材： 载玻片 盖玻片 加样枪及枪头 显微镜 计数器 试管架 药品： 伊红Y、 pH7.4的磷酸缓冲液配制 结果判定： 活精子不着色，死精子着红色 精子活率（%）=（活精子数/计数精子数）×100% 精液白细胞检测 染色方法： 采用联苯胺染色方法 原理： 当细胞存在过氧化物酶活性时，它可将H2O2分解，产生新生态的氧，使无色的正甲苯胺被氧化成蓝色的甲苯胺盐，后者进而形成棕色物使细胞着色。 试剂： ① 125mg联苯胺　②50ml95%甲醇 ③150mg玫瑰红 ④50ml蒸馏水 ⑤0.3% H2O2 步骤： ① 取新鲜精液1滴于载玻片上，加入1滴联苯胺染液，混匀，置盖玻片后，于37℃放置20min,镜检。白细胞染成褐色，其他细胞染成品红色。 器材： 载玻片 盖玻片 加样枪及枪头 显微镜 计数器 试管架 药品: 联苯胺、玫瑰红、0.3%双氧水、甲醇、蒸馏水 结果判定： 白细胞染成棕色 白细胞率（%）=（精子密度/100）×100% 冷冻方法 [精液冷冻发展过程] 1776年，Spallanzarni首先发现埋藏于冰雪中精液经过复温后有一部分精子存活下来，开始了对冷冻保存生物技术研究。 1866年，Montegazza在-15度条件下成功的保存了人类精子。 1937年，Jannel报道了人精子在-79度（干冰），-196度（液氮），-269度（绝对零度）下可以保存很长时间。 1942年，Hoagland和Pricus用快速冷冻方法将人类精子成功的保存于-196度液氮中。 1949年，Polge发现了甘油对精子的特殊保护作用及其它冷冻保护剂的研究成功和液氮工业化生产工艺的使用，才使得精子冷冻保存成为安全、有效而简便的方法。 1953年，Sherman用冷冻精子进行人工授精并取得成功。 自1963年，Sherman提出了行之有效的精子冻存方法后，有关冷冻技术研究得到了长足发展。 [冷冻原理] 细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至 -5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至 -5～-15 ℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。 冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够时间外渗，结果随着温度下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。 缓冻法是目