课题2 多聚酶链式反应扩增DNA.pptVIP

自学提纲： 知识回顾： 1.DNA分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；2. DNA复制过程和特点； 3.PCR技术概念及应用。 基本概念：变性、复性、Taq DNA聚合酶、引物 理解PCR技术的原理 掌握PCR技术的全过程 比较PCR技术和体内DNA复制的异同点。 一 、PCR技术的原理 利用DNA分子的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’ 端向 3’端延伸。 二、PCR的反应过程 三、实验步骤： 注意事项：详见操作提示 * * 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 1、DNA分子的3’ 端与5’ 端 -OH端为3’ ; 磷酸基团的末端为5’ 。 2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸 思考：3、体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 变性（ 80-100℃ ） Taq聚合酶（耐高温） 15—30个核苷酸构成DNA或RNA DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 4、DNA 分子的热变性原理： 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10分钟 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P63） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。 练习巩固 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘ D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？ 3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作 4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在—20 ℃储存 * * *