生物技术(基因工程).解读.pptxVIP

基因工程 ;20世纪70年代初,利用重组DNA实验将哺乳动物基因导入细菌体内,并表达成功,开创了生物技术制药工业.短短20余年时间就获得了诸如人胰岛素、人生长素、α-干扰素、白细胞介素-2等多种生物技术药品,并已上市.1997年美国已批准上市的基因工程药物、疫苗和注射用单克隆抗体达39种,2004年已超过150种.;自20世纪70年代基因工程诞生以来,最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学,基因工程技术的迅猛发展是人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质,甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质.;概念 也叫 基因操作 遗传工程 重组DNA技术 ; 用人工方法，把生物的遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表 达的技术。 ;克隆目的基因，取得所需要的DNA特异片段。 与DNA载体连接成重组DNA。 引入细菌或动植物细胞并使其增殖。 挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。 ;（一）核酸分子的提取技术 （二）电泳技术 （三）各种酶的使用 （四）基因克隆 （五）体外重组 （六）载体构建 （七）转化 （八）重组体的筛选与鉴定 （九）培育新型品种 ;分类： RNA的提取 总DNA的提取 质粒DNA的提取 方法：首先，粉碎组织细胞； 其次，DNA用乙醇等进行沉淀； 最后，用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。 ;概念： 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种生物大分子在一定pH值条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。 分类： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。 ;1、限制性内切酶的使用 概念：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3′-OH基团和5′-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 分类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。 ;2、DNA连接酶的使用 DNA连接酶能够催化具有3′-OH基团和5′-P基团的DNA片段之间形成磷酸二酯键。在基因克隆中用来连接载体与目的基因。 ;3、DNA聚合酶的使用 DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3′-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。 ;4、逆转录酶的使用 逆转录酶可以RNA为模板合成DNA，即cDNA（互补DNA）。在基因克隆中常用来构建cDNA文库。 ;1、克隆已知基因序列的基因 一般用PCR 扩增方法，根据已知基因的序列设计引物来克隆基因。 在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建cDNA 文库或基因组文库，然后以该基因（或部分序列）为探针来筛选目的基因的克隆。 ;2、功能克隆 根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行PCR扩增。 ;3、作图克隆 作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。克隆植物分子连锁图谱定位的基因，可采用作图克隆的策略。作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆（BAC或YAC库）的染色体步移到达靶基因。 ;4、 表型差异克隆 利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。 （1）消减杂交法 （2）DNA 标签法 （3）差别显示技术包括：mRNA 差别显示法等。 （4）缺陷互补和反义mRNA技术 （5）cDNA微阵列和基因芯片技术 ;5、染色体大片段基因克隆 利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。; 是将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA 分子。; 理想的运载体是质粒，当给它安装一段外来 DNA片段后，它依然如故地进行自我复制。;1、植物转基因技术 （1）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵培养。 ;（2）基因枪法 又称微弹轰击法。其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化，