实时荧光定量PCR技术重点分析.doc

实时荧光定量PCR技术的研究进展及其在水产养殖中的应用 M140101006 高金伟 摘要：实时荧光定量PCR的是继常规PCR之后分子生物学方法学研究的一大飞跃，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中广泛应用，已成为分子生物学研究的重要工具。本文从实时荧光定量PCR技术的原理、荧光标记技术、定量方法以及实时荧光定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状作了一个综述。 关键词：荧光定量；PCR；荧光标记；水产养殖 实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative PCR, real-time FQ-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在荧光定量PCR技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键的作用：一是Taq DNA多聚酶的5’端核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记的探针，使得间接检测PCR产物成为可能；另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。在1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种实时荧光定量PCR 技术，它是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析[1]。该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点[2]。目前已得到广泛应用, 包括对mRNA表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析。 1 实时荧光定量PCR技术原理 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1.1 工作原理 在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。而用于常规PCR的专门热循环仪配备荧光检测模块，可监测扩增时的荧光。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是指当标记在探针的5’端荧光报告基团(reporter R)未被标记在3’端淬灭基团(quencher Q)抑制时，可检测到报告基团的荧光信号。检测到的荧光信号的强度与PCR反应产物的量成正相关，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 1.2 定量原理 实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期2个阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，反应进入平台期(28~ 40个循环)。只有在荧光信号扩增期PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以在指数期的某一点上来检测PCR 产物的量，并由此推断模板最初的含量。设定一定的荧光信号的域值(threshold)。如果检测到荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数Ct( C代表循环cycle,t代表域值threshold) [3]。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。公式表示：Ct = -k logX0 + b(X0指原始模板数)。利用已知起始拷贝数的标准品可做标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 2 实时荧光定量PCR荧光标记技术 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。探针类荧光标记物是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，荧光染料是利用其它的一些理化特征指示扩增产物的增加。前者因增加了探针的识别步骤，特异性更高；后者的优点是简便易行。 2.1 荧光标记探针 按其基团标记和能量转移的方式, 目前已经开发出几种相关的技术, 大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqManTM探针(水解探针)、TaqMan MG