实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定重点分析.docVIP

实验蛋白质的蛋白质的 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都重要的意义通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 试剂和器材 一、 试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1(10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL LB液体培养基中 （含100μg/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1-5mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取1ml 培养物用于SDS分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L, 37℃继续培养1-3h.。 4. 12,000rpm 离心5 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。 二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化 1. Ni2+层析柱的准备：在层析柱中加入1mL Ni2+介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液（GLB）洗涤。 2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，用振荡器轻柔的混匀样品60min, 4℃或室温 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10μl 上清样品用于SDS分析。 3. 上清样品以10-15mL/h 流速流经Ni2+层析柱，收集流出液，取10μl样品用于SDS分析。 4. 洗脱杂蛋白：用清洗缓冲液（UWB）50mL以10-15mL/h流速洗涤层析柱，去除杂蛋白，直至OD280 = 0.01，约3-4h，取10μl洗涤结束时的样品用于SDS分析。 5. 洗脱目标蛋白：用洗脱液缓冲液10mL洗柱，每管1 mL分部收集洗脱液，共收集6-10管，分别取10μl样品用于SDS分析。 第二部分 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶 （2）掌握凝胶 电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入种试剂使电荷因素消除，电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷可引起构象改变，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。 试剂和器材 一、试剂 [1] 30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 [2] Tris-HCl/SDS，pH 6.8：在40