利用EBV转化人类外周血B淋巴细胞获得永生化细胞株讲义.doc

利用EBV转化人类外周血B淋巴细胞获得永生化细胞株保存人类全基因组 摘要：人类外周血B淋巴细胞可以被Ebv在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的LCL。保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化。环孢霉素A法是建立珍贵样本的LCL的首选方法。采血12到36小时分离转化B淋巴细胞，转化液中添加cysA、pha，控制转化时细胞数量在10/ml数量级有助于提高建株率。37℃5%二氧化碳恒温培养，及时添加新鲜的RPMI 1648培养液以及全程无菌操作防止细菌真菌污染至关重要。慢冻迅速升温是冻存、复苏的关键。原代和继代之间G条带分析、核型对比、对常见变异位点应用PCR进行质控有助于发现LCL的细胞变异。 关键词：EBV 转化 B淋巴细胞 LCL 人类外周血B淋巴细胞可以被EB病毒（Epstin-Barr Virus,EBV）在适当的体外环境中转化成具有永生化特征的人类淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell lines,LCL）。该细胞株保存了各人的完整基因组，且其生化和分子生物学特征不发生变化。因此，利用EBV建立具有人类全基因组的永生化细胞株，成为保全全世界各民族特有种群基因及研究人类缺陷基因疾病乃至人类长寿基因探讨的首选方法。近十年来，我国使用这种方法建成了十多个少数民族以及基因缺陷疾病、免疫抗体技术甚至长寿人群家系的LCL，其应范围也已经突破医学延伸至体育领域。事实证明，建立能永久保存的细胞系是打破传统研究中研究的接力式进行与样本的暂时性存在矛盾的关键所在。 1 EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL的机制及病毒来源 EBV转化人类外周血B淋巴细胞的机制尚未完全明晰，可能与p53抑癌基因依赖的正常细胞调控机制被抑制以及端粒酶活性增强有关。p53是通过阻滞正常细胞由G1/G0期进入S期来诱导细胞凋亡的。尽管EBV转化的LCL细胞内p53水平增高，但由其介导的细胞凋亡事件能被EBV本身的潜伏蛋白和EBV诱导的细胞蛋白所中断，从而使LCL获得了无限增值的能力。同时，EBV转化的LCL端粒酶活性显著提高，维持了正常人体细胞端粒的长度，使LCL逃逸了细胞的M1、M2期获得了永生化。由EBV转化获得LCL的过程是一种可逆转的现象，这就相当于赋予了LCL永生化特性的同时又没有赋予其复杂的肿瘤背景，从而令LCL成为深入研究细胞永生化机制的良好模型。 EBV是一种已知序列的病毒，其插入人类基因中时主要以完整插入为主，这种特性可以被我们加以利用，方便在以后的研究中剔除相关影响。EBV可以利用细胞培养的方法大量获得。市售的B95-8细胞具有永生化特征，使用RPMI 1640培养基、37℃、5%CO2条件即可在体外大量增殖。B95-8细胞经饥饿裂解之后，通过离心、过滤后获得的培养上清液富含EBV，具有可使人类外周血B淋巴细胞转化为永生化细胞的能力，该上清液还可以分装、冻存，方便实验员使用。我国现有的EBV主要有三个来源，即上海生物制品所（上生所）、昆明动物研究所（昆明动物所）和中科院人类发育与遗传研究所（中科院遗传所）。笔者曾于2001至2003年间使用中科院遗传所馈赠的EBV，运用EBV转化加环孢霉素A的方法建立涵盖百岁老人至其66岁以下直系亲属共65株永生化细胞株，并在随后的几年间陆续建立起累计超过140株永生化细胞株且全部经冻存、复苏验证成活。 2 使用EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL细胞株的方法 使用EBV转化人类外周血B淋巴细胞建立LCL细胞株的过程大致分为五个步骤，即分离B淋巴细胞、EBV转化、LCL细胞培养、LCL细胞验证冻存和LCL细胞复苏培养及再冻存。当前比较成熟的利用EBV转化人外周血B淋巴细胞建立永生化细胞株的方法有三种。分别是环孢霉素A法、微量全血法及冻存全血法。环孢霉素A法通常在培养液中加入终浓度为2ug/ml的环孢霉素A（CysA）及终浓度为0.5% 的植物血球凝集素（pha），且需要分离B淋巴细胞并将其细胞数量调整到10个/ml级别才能转化，虽然操作较复杂，但一次性建株成功率高。微量血细胞法不必分离B淋巴细胞，不添加CysA及pha，直接使用0.1ml抗凝全血进行转化。冻存血法的实质是微量全血法，仅仅是在转化前处理样本时将抗凝全血与适量的抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）混匀分装成小支冻存，以便在首次转化失败后的两年内能再次复苏样本进行多次转化以达到提高建株成功率之目的。有文献报道，微量全血法和冻存全血法建立LCL的成功率分别为46%及85%。笔者采用环孢霉素A法三次建立LCL时成功率分别为66.6%(24/36)、96.4%(53/55)和64.7%(66/102)，与相关文献的建株成功率相符。建议：对于珍贵不可第二次获得的样本的处理首选环孢霉素A法；微量全血法主要应用在大样本来源时；