耐盐柳树BADH基因克隆及表达讲义.doc

耐盐柳树BADH克隆及表达分析 大多数高等植物在受到盐、干旱等胁迫时会在细胞内大量积累甘氨酸甜菜碱(glycine betaine, 简称甜菜碱) 来提高自身抵抗逆境环境因子胁迫的能力。甜菜碱作为季胺类水溶性生物碱，具有渗透调节功能，能够保护质膜的完整性，有助于植物适应非生物逆境。耐盐柳树，杨柳科柳属，乔木，生长潜力大，与一般的柳树的区别是具有较强耐盐碱性，能在含盐4.‰，Ph10.4的土壤中正常生长，是我国沿海滩涂主要的造林树种之一。具有适应性强，易繁殖，造林成活率高，生长迅速，无论在营造工业用材林，还是在防风固沙，水土保持，盐碱地改造等方面都有广阔的应用前景。目前，国内外学者已从川芎（Liqusticum churning Franch Hort）、枸杞（Lycium Barbarum）、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、甘菊(D endranthema lavandulifolium)、胡杨（Populus euphratica）、辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis）、梭梭（Haloxy lonammodendron）、盐爪爪（Kalidium foliatum）、大麦( Hordeum vulgare L.)、盐穗木（Halostachys caspica）等[]-[13]植物的BADH基因也相继得到克隆。迄今为止，有关耐盐柳树的BADH基因的研究还未见报道。本文从耐盐柳树中克隆了BADH基因, 探讨了其与其它品种或物种同源基因的相似性，并构建了系统进化树，并对其进行了序列分析和在盐胁迫下的表达分析，为耐盐柳树种质改良的研究奠定基础。 1 材料与方法 植物材料 江苏沿江地区农科所所选育耐盐柳树L0911新鲜叶片，取样后用液氮速冻存于-70℃冰箱待用。 实验试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP（10 m）、Marker和 PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141）生工 SK1191 UNIQ-10SK8661）、常规化学试剂等均购自上海生工。 1.3 RNA提取和总cDNA的合成 采用TRIzol试剂（Invitrogen 公司），并参照试剂说明手册提取总RNA。总cDNA的合成AMV逆转录酶（BBI 公司）反转试剂盒说明书进行。 1.4 L0911的BADH基因的克隆 毛果杨（Populus trichocarpa）BADH BADH f1：5′? AGCTCTCAACTCACTAATCGAGT?3′；BADH R1：5′?TTATAGCTTGGCGGGAGACTG?3′。以L0911叶片总cNDA为模板，PCR产物经 1％琼脂糖电泳后，切胶回收，并进行T/A克隆pMD18?T）。阳性克隆送上海生工公司测序。所得的克隆的序列为2次独立PCR和3个以上质粒测序的结果。 1.5 植物BADH基因的分子进化分析 在GenBank查找BADH 基因的核苷酸和氨基酸序列相关的序列，使用Clustal W2进行多序列比对，MEGA5.0软件中Neighbor-Joining（NJ）法进行建树，Bootstrap值设为1000。1.6 柳L0911的盐处理 将L0911水培生长健壮的幼苗用200mmol.L-1NaCl溶液处理0，3h，6h，9h，12h，24h，48h，72h，分别取新鲜嫩叶片；将L0911幼苗用0、100 mmol.L-1、200mmol.L-1 、300mmol.L-1 NaCl溶液处理h，分别取新鲜嫩叶片。将样品用液氮速冻存于-70冰箱待用。 1. 实时荧光定量PCR分析L0911 BADH根据测序结果，设计引物BADH F25′?GTGCCAAGTATTTGCGTGCTA?3′）和R2（5′?AAACAACCTGCGACATCATCC?3′），对L0911 BADH内参基因[14]，用ubiquitin-like（UBQ-L）为基因，引物为UBQ-L-F（5′?TGAGGCTTAGGGGAGGAACT?3′）UBQ-L-R（5′?TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG?3′）。各1.3方法进行总RNA提取以及cDNA合成。按柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（SK8661）操作配置PCR体系，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪检测，测定其Ct值，用F=2-△△Ct公式[15]计算出样品间目的基因表达量差异。 2 结果与分析 2.1 柳L0911 BADH基因的克隆用毛果杨（Populus trichocarpa）的PtBADH基因设计的引物F1和R1能成功的在柳L0911的cDNA模板中进行扩增（图1），且长度的大小符合预期。进一步通过克隆测序后分析表明，L0911的BADH基因cDNA全长1539bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框（1