生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结讲义.docx

 PAGE \* MERGEFORMAT 10 生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。 （2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。 （2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。 （3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，一种常染色体隐性遗传病，病因为先天性缺乏尿黑酸氧化酶基因表达。 （2）疾病的基因诊断：从广义上讲，大多数疾病都可以从遗传物质的变化中寻找出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因诊断便立即可以实现。以P53抑癌基因为例，典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表达出来了。 （3）疾病的基因治疗：即是通过基因水平的操作来治疗疾病的方法。包括体细胞治疗和生殖细胞治疗两种，后者所产生的性状可代代相传。 （4）疾病的基因预防：研制基因疫苗，即能编码某种特异性抗原并在人体或动物体细胞内表达这种抗原的DNA或RNA等。 4.基因载体在基因工程中的作用 基因载体的功能包括运送外源基因高校转入受体细胞、为外源基因提供复制或整合能力以及为外源基因的扩增或表达提供必要的条件，分为质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等。 质粒载体的主要用途有：（1）保存和克隆小于2kb的目的基因，（2）构建基因组文库和cDNA文库，（3）用于目的基因的测序，（4）作为核酸杂交时探针的来源。 λ噬菌体可以容纳较大的目的基因，基因文库构建常使用λ载体。 二、1. 掌握PCR技术的原理及基本步骤 PCR技术的原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 基本步骤：包括变性--退火--延伸三个基本反应步骤。（1）DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。（2）退火(复性)(40℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。（3）延伸(68℃-75℃)：在Ta