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生物資訊原理作業四 醫技所 吳致勳 What is the major difference between 454 and Solexa technology? 此二技術皆屬於NGS(Next generation sequencing)，相較於傳統的sanger的定序法，完全不需要細菌來進行質體的複製，就能進行定序，成本較低，也具有很高的輸出量和低錯誤率，此二技術之差異性比較，說明如下: (1) 454 technology 454 technology (roche公司)首先把DNA分離出來，打斷為300-800bp之小片段，再於片段其兩端連接上adapter，後把此片段加入特殊之磁珠上方，而該磁珠表面具有與adapter互補之序列、直徑約 28 μm，並以油水混合之水滴為test tube，藉乳液聚合酶鏈鎖反應(emulsion PCR) (PCR-reaction-mixture-in-oil emulsion)提高磁珠表面上之DNA產物(DNA amplification)，每個小片段會被增加1百萬倍。而定序方式為pyro-sequencing:將這些表面上具大量DNA產物的磁珠放入微孔盤，盤上每小孔只能放一磁珠，並依序加入四種具不同鹼基的dNTP，後以聚合酶進行核苷酸接合，接合時會放出焦磷酸根離子(pyrophosphate)，其透過ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase) 轉換生成ATP，再經由luciferase接受ATP所提供之能量，放出可見光，可由光感測器來得知訊號，透過反覆的試劑置換與偵測，能獲得定序結果，最後以軟體加以分析，可配對出完整之序列。但若有5鹼基的連續序列，無法精確測得。 Read length:200-400base，相較之下sanger傳統法Read length:900base低 總輸出量 一條line2500萬reads/run(8條line 二億reads/run，相較之下sanger傳統法96reads/run少 data/run:0.1(Gb)，time/run:7.5hrs (2) Solexa technology Solexa technology(illumina公司)( Illumina Genome Analyzer)首先把DNA打斷為200-500nt之片段，再於片段其兩端連接上adapter，後把此片段放入晶片上方，而該晶片表面具有與adapter互補之序列。接著以橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge PCR)提高晶片表面上之DNA產物(DNA amplification)，使DNA 片段在晶片上長出叢集(cluster)，若前幾個base相近，視為同一叢集。接著進行定序，定序為Single-molecule polony sequencing方式，polony指由polymerase所產生之單一分子colony，並利用Reversible terminator chemistry，加入四種具不同base且具有可移除螢光分子的dNTP及反應試劑，反覆進行螢光標記之移除、試劑置換和偵測，則可得知定序之結果，最後以軟體加以分析，可配對出完整之序列。 Read length:150-2*150base，data/run:1-3(Gb)較長， time/run:3-5days(每日產出資料量高：a. sequence output ≥ 1,600 Mb/day b. ≥5 Gb/3days for a single-read run, ≥10 Gb/6 days for a paired-end run for up to eight samples 高正確性：≥99.99% consensus accuracy at 3xcoverage How can sequencing be used to measure gene expression? 在RNA-Seq中，若單純只以某基因序列所map到之read數，就決定該基因之表現量無法表示真實之情況，因為依照統計上隨機抽樣之觀念，序列較短的基因，被抽到的機率自然會比序列較長的基因來的少，則序列短者都會被誤認為其表現量就低，造成表現量判斷之錯誤。因此必須使用一RPKM(RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads) 之方法處理定序資料，以得到基因之表現量。RPKM定義如下: RPKM=total exon reads/[mapped reads (millions)*exon length(KB)] total exon reads/mapped reads (millions) 表示在所有read中