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活载体疫苗 概念：利用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。 * 特点：此疫苗具有常规疫苗的所有优点，而且便于构建多价疫苗，建立鉴别诊断方法。 但成功的关键取决于外源基因的表达水平，此类疫苗不能进行二次免疫。 * 实例：痘苗病毒+狂犬病毒G蛋白基因，鸡痘病毒+多种其它禽病原基因，伪狂犬病毒+其它猪病原基因，…… * 病毒复制非必需片段基因鉴定 病毒复制非必需片段基因克隆 外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体) 将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子 筛选稳定的重组病毒 重组病毒活载体研制原理 复制非必需基因 外源基因 病毒 转染 连接 * 分别扩增左臂片段（L）和右臂片段（R） 分别克隆L、R片段于pBluescript M13- 转移载体pSKLR 转移载体pSKLRG 目的基因完整表达盒 2对引物 猪伪狂犬病病毒弱毒株构建活载体疫苗的构建思路 BHK21 Cells PRV 143TK- Cells 鉴定 鉴定 * 纯化PRV 提取PRV基因组 技术路线 经sph1、kpn1酶切 含gG、gD、gE基因 PUC18载体 质粒PUSK 质粒PAcGFP-C1 重组质粒PUSG 质粒PIRES-ORF2 构建重组质粒PUSGO 构建重组质粒PUSGI 质粒PIRES-IL-2 * 技术路线 质粒PUSGO 质粒PIRES-IL2 重组质粒PUSGOI TK-/gE-PRV基因组 PK-15细胞 重组病毒 纯化 PCR RT-PCR 间接免疫荧光 * 病毒活载体疫苗的缺点： 使用同一载体的不同疫苗不能同时使用 解决办法： ①构建多价疫苗 ②构建多种可用的载体 ③建立合理的免疫程序 病毒活疫苗、灭活疫苗及病毒活载体疫苗配合应用。 * 四、基因疫苗 概念：将病原的保护性抗原基因与含真核启动子的质粒DNA连接后直接导入动物体内，在机体内表达相应抗原蛋白，诱导机体免疫系统产生对相应抗原的免疫保护作用。 * 特点：与传统疫苗相比，基因疫苗具有制造简单、生产速度快，成本低、容易控制质量、免疫期长、热稳定性好、便于贮藏和运输。 * 基因表达产物虽然相当于亚单位蛋白产物，但由于产物表达于宿主细胞内，可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫，具有弱毒活疫苗的效果，并且容易制作多价疫苗。 * 同样，利用非疫苗用的基因编码的病原蛋白抗原或抗体建立的诊断方法可以区分DNA疫苗免疫的动物和自然感染的动物。 * DNA Vaccines plasmid Muscle cell Gene for antigen Muscle cell expresses protein - antibody made CTL response 由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。 * ① 目的基因的分析 ② 选择合适的表达载体 ③ 测序确认编码序列 ④ 体外转录／翻译验证试验 ⑤ 动物试验 ⑥ 结果评价 基因疫苗构建的基本步骤 * pMDTH BamHI pcDNA3.1 BamHI CIAP pcDNAH pcDNA-IL18 PCR BglII Ligase CIAP BglII pcDNAH-IL18 PCR鉴定 酶切鉴定 瞬时转染 PCR鉴定 SDSWestern Blot Ligase Cos7细胞 鸡的免疫 MTT检测 ELESA检测 保护率的测定 * 　BamHI 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 CIAP 　BamHI　 T4 DNA ligase 重组质粒的构建流程图 * 五、 合成肽疫苗 概念：利用人工方法合成病原具有保护作用的抗原多肽，辅以适当的佐剂和载体制成的疫苗。 实例：口蹄疫病毒合成肽疫苗（UBI公司）。 * 特点：不仅安全可靠，质量可控，而且可以随时根据流行毒株的情况加以调整，利用非疫苗用蛋白抗原建立的诊断方法也可以区分疫苗免疫的动物和自然感染的动物。 但是，一般情况下这种疫苗成本较高，只适于含线性表位的多肽，不适于构像依赖性表位。 * 六、转基因植物可食疫苗 概念：将病原主要保护性抗原基因导入植物形成转基因植物。利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白作为疫苗，或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫。 特点：便于大量生产，饲喂方便。 但动物个体的摄入量不一，免疫效果不易保障，此疫苗只适用于粘膜免疫为主的疾病（如胃肠道传染病）。 * 谢谢大家！Thank you! * * * Reverse Geneti