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中国医学科学院北京协和医学院
目 录
摘要……………………………………………………………………………………1
Summa巧………………………………………………………………………………3
前言……………………………………………………………………………………5刖舌……”……………………………………………………………………………‘5
一、实验材料…………………………………………………………………………9
(一)菌株及载体……………………………………………………………………9
(二)病毒及细胞……………………………………………………………………9
(三)主要试剂………………………………………………………………………10
(四)主要仪器………………………………………………………………………1l
(五)实验动物………………………………………………………………………12
二、实验方法…………………………………………………………………………12
2
(一)引物设计及合成………………………………………………………l
1．EV7l特异性检测引物合成……………………………………………………12
2．基因的克隆合成…………………………………………………………………12
(二)毒株的分离、传代及滴度检测………………………………………………13
1．EV71原代分离…………………………………………………………………13
2．EV7l病毒的扩增及滴度检测…………………………………………………13
(三)毒株的鉴定……………………………………………………………………14
1．形态学检测……………………………………………………………………14
2．血清中和实验…………………………………………………………………14
3．异核酸片段的鉴定……………………………………………………………15
(四)目的基因的克隆及穿梭质粒的构建…………………………………………15
1．目的基因的克隆………………………………………………………………15
2．双顺反子的构建………………………………………………………………16
3．穿梭质粒构建…………………………………………………………………17
(五)重组腺病毒质粒的构建………………………………………………………18
1．重组穿梭质粒的线性化及去磷酸化…………………………………………18
2．穿梭质粒与复制缺陷型腺病毒载体的重组…………………………………18
3．阳性重组腺病毒质粒的大量扩增……………………………………………18
(六)重组腺病毒的包装……………………………………………………………20
1．重组腺病毒转染293细胞……………………………………………………20
2．重组腺病毒收获，传代………………………………………………………20
中国医学科学院北京协和医学院 硕士研究生学位论文
3．重组腺病毒滴度检测…………………………………………………………20
4．重组腺病毒蔗糖垫浓缩………………………………………………………2l
(七)目的基因表达的检测…………………………………………………………2l
1．1汀．PCR检测…………………………………………………………………2l
2．免疫荧光检测…………………………………………………………………22
3．免疫细胞组化检测……………………………………………………………22
(八)实验动物免疫…………………………………………………………………23
1．EV7l特异血清获得……………………………………………………………23
2．重组腺病毒免疫BALB／C小鼠………………………………………………24
三、实验结果及分析…………………………………………………………………26
(一)分离毒株在Ver0细胞上的生长特性………………………………………26
(二)分离毒株的特异性……………………………………………………………26
1．血清中和试验…………………………………………………………………27
2．EV7l特异性基因片段鉴定………
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