377操作流程.docVIP

前期准备： 各种试剂的配方和注意事项 50％聚丙烯酰胺变性胶母液 95g Acrylamide 5g Bis- Acrylamide 加100ml双蒸水在热水浴（其溶解过程为吸热过程，加热只为加快溶解速度）中溶清后定容至200ml即可 4℃保存 Acrylamide，Bis- Acrylamide有毒，配制时需小心。 Acrylamide，Bis- Acrylamide溶解吸热，需长时间溶解。 10×TBE 107.8g Tris 55.0g 硼酸 7.44g EDTA(Na2） 将上述药品溶清、定容之1000ml后装入10×TBE试剂瓶中即可。 10×TBE试剂瓶应用稀盐酸清洗，以免有Tris残留导致TBE中的Tris沉降。 5％聚丙烯酰胺变性胶 105g 尿素 25ml 50%聚丙烯酰胺变性胶母液 25ml 10×TBE 溶清后定容至250ml即可 每次稀释时注意50%聚丙烯酰胺变性胶母液从冰箱中取出会有析出的晶体出现，须在溶清后使用。 试剂配制好定容后，需要抽滤。 4℃保存。 10％过硫酸铵 将0.1g 过硫酸铵(APS)加入到1ml去离子水中。 要每天新制(或冰箱保存) 要4℃保存 每次配(两个星期的)8ml-分装 Blue Dextran Loading Solution 88.25％（V/V） Forrnamide（去离子甲酰胺） 11.75％（V/V） 4.1mM EDTA (pH8.0) 分子量：292.25mg／ml blue Dextran（蓝色葡聚糖） blue Dextran很昂贵要注意节省。注意最小称量。 4℃保存 每管装上样缓冲液8ml,加blue Dextran 0.06g 【0.1g蓝色葡聚糖2000，去离子甲酰胺6ml】现用此配方 制备聚丙烯氨凝胶 将板子从机器上卸下，在工作台上放平，把玻璃板从架子上拿出来，然后用软尺从板子背面顶进将上下两块玻璃板分开。在清洗前先用报纸或者粗糙的纸沾掉上次使用过的残胶。然后用水和无磷洗涤剂清洗玻璃板，在清洗的过程中要先冲掉玻璃板上未沾掉的残胶然后用蘸有洗涤剂的柔软的布擦拭，最后用去离子水彻底清洗。板子一定要洗干净，不然会对结果有影响。让玻璃板在无尘埃环境中自然干燥。干燥时玻璃板内侧应向里摆放. （有字的一面为不接触胶的外侧.） 待玻璃板完全干燥后将下面的玻璃板放在架子上,内侧冲上,再放上垫片然后是另一块玻璃板,内侧朝下,玻璃板下沿和垫片要注意对齐。用架子上的夹子(每边3 ~4个)将前后玻璃板固定好。 用30CC注射器取5％聚丙烯酰胺凝胶21ml，并加入新配制的10%过硫酸铵125ul和TEMED13.5ul温和混匀。用30CC注射器将混合好的凝胶缓慢注入平放的玻璃板中，注入凝胶的同时应用洗耳球拍打，帮助胶液缓慢平稳移动，避免产生气泡。在胶液出现V形状的地方应重点拍打. 待胶流到玻璃板底部后，在玻璃板间反向插入64孔的鲨鱼齿梳。用3个夹子固定梳子。剩余的胶倒入小烧杯，作为聚合反应的参照物。聚合反应持续2小时以上，检查聚合反应对照物以确保聚合反应完全。 凝胶预电泳 聚合结束后，从板子上上取下夹子，小心拔下梳子。用枪头除去玻璃板间多余的聚丙烯酰胺凝胶。再用去离子水将玻璃板间的残胶冲出，注意不要留下气泡。将梳子洗净后正向小心地插入玻璃板中，梳齿稍微入胶约0.2毫米。用纸巾将玻璃板上的扫描区擦净后，将架子放上机器，用机器上的四个卡槽固定好。 将上缓冲液槽用卡槽固定在玻璃板上，将1xTBE 缓冲液加入到仪器的上下缓冲液槽中。缓冲液不宜过少上槽需要没过梳子上的数字，下槽加满。 用充满缓冲液的30cc 注射器吹去梳子上和梳齿内的气泡，用弯头注射器移去胶底部的气泡。 连接所有电极，关上仪器门，打开ABI PRISM? 377 DNA 测序仪收集软件，选择“Files”-“New”- “Gene Scan Run”，就可以开始一个新的测序程序。点击“Plate check键检查胶的荧光基线。看玻璃板是否干净。若无问题点击Cancel中止程序。如果基线不水平，须将玻板从卡槽中取出并重新擦拭玻板表面，重新检查玻板。 在“Plate check过程中，可以用梳子比对，以避开不干净的加样孔。 使用GS 36F-2400作为“PreRun”和“Run”的程序。该程序设置的胶温度为51℃，电流为40MA，电压为3KV。点击“PreRun键开始预电泳15-20 分钟或预电泳至胶的温度达到51℃。打开状态窗口Window → Status以检测凝胶温度和电流电压大小。一般新胶温度达到51℃时，电流为40MA，电压为2.4-2.8KV,旧胶电流为30MA