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HPV高危型检测步骤 注意事项（Digene HC-II） 1标本处理 实验室温度要求保持在20-25度。 标本和试剂盒自冰箱拿出后应在室温下放置一段时间，使其温度至室温。 开水浴箱、加热器，以节省时间。DML2000主机应在检测前，以使它处于最佳工作状态。 注意核对编号。勿弄错标本。 涡漩混匀时，要看到液面被拉起。 使用移液器时，枪头注意不要在取液时碰或刮到容器口或壁，否则应更换枪头。 如移液器碰到管壁或接触到液面，应用HCLO次氯酸马上擦试移液器头部消毒后方能再用。 2 裂解 45’ 将裂解液按使用量倒出一部分在干净的试管中，以免污染整瓶试剂。 加裂解液至各管时，注意加入NC和PC的裂解液的量是不同的。 水浴前要盖紧盖。水浴箱的水量不要浸没试管,但是要在试管液面以上。 水浴的时间视温度的变化可适当延长缩短。 配备HPV Probe时要注意先换手套，以免污染探针。 3 杂交 60’ 探针的量要准确，以使每个标本的反应条件近似相同。 加完探针后，要注意检查一下微孔板是否有漏加或重复加的现象。同时，在加质控及标本时，要注意核对标本的正确性。 膜要贴紧、平，以防振荡和孵化时发生孔与孔的交叉污染。 振荡时间不一定3分钟，只要颜色变黄就可以了。振荡后检查各孔是否变黄，如有一个或几个孔没有变成黄色，则可延长振荡时间；如仍未变色，则可撕掉胶膜，在未变色的孔中补加25 ul探针，再贴上胶膜，重复振荡，观察颜色变化。 孵化60分钟 的时间，应尽量遵守，不要过长过短。孵化过程中，不要振动孵化器。 从孵化器中拿出后，避免剧烈振动,放稳后立刻撕掉封胶纸,避免挥发和孔间交叉污染。另外也避免试剂会蒸发在膜上，影响结果 在加样进微孔板时，注意枪头应进入约三分之一的孔的深度，枪头倾斜一定角度（42~60度）以免液体溅出污染。 4 捕获 60’ 转移时务必尽量将每个孔的液体吸净。 振荡60分钟 ，这个时间可延长但不能缩短，可在这个时间安排饮食休息。 在振荡前应检查一下振荡器的振荡频率和时间设置（在HOLD处）。 5 反应 30’ 在吸出液体时，注意尽量不要碰到孔壁,更不能用吸嘴刮捕获孔壁，以防将有用物质从孔壁刮除。 将DR1按使用量倒出一部分在干净的试管中，以免污染整瓶试剂。 在20-25。C 放置30分钟，注意室温的要求。 吸去DR1时，移液器尽量不要碰到捕获孔的孔壁，否则可能会影响结果。 拍打时，不可在同一位置重复拍打。每拍打一次换一个位置。 6 冲洗 5’ 冲洗 6 次，次数不可过多。冲洗要有一定的冲力，垂直冲至孔底，并可看到从孔中溢出的反流上来的水柱。按”之”形的顺序冲洗，每孔冲洗的力度和时间尽量一致。 冲洗所用的蒸馏水必须是双蒸水，如无，可用屈臣氏蒸馏水替代。冲洗所用水的质量直接决定着实验的的成功与否。大型生化仪生产的双蒸溜水较理想也方便。 在每次冲洗的间隙可进行一分钟泡板，或振动微孔板。 冲洗后换手套，以免被DR1污染。 7 收集信号 15’ 将DR2按使用量倒出一部分在干净的试管中，以免污染整瓶试剂。 加DR2后，一定要将微孔板立即放入黑暗处（直接放入DML2000光度计中）。 8 判读 15分钟左右，在DML2000系统上判读，分析演绎结果，打印报告。 注 意 事 项 注意室温是否在20-25。C，各项试剂均需在此室温下； 所有在实验中使用的液体在使用前，必须用Votex涡旋混合器混匀； 一个新的试剂盒开始使用时，质控会被第一次裂解，经裂解后的质控，在下一次检测时不必再次裂解； 本HPV检测试剂盒可分批使用，但建议不要超过五次，最好不要超过三次。以免多次使用造成污染； 每次检测时，按微孔板位置第一列前1-3孔固定为阴性质控孔，4-6孔固定为阳性质控孔。7-96孔为标本检测孔(如做QC,则第7孔为QC2，8-96孔为标本检测孔)； 建议每次均做QC2质控，其范围在2~8，理想值在4~5，其结果是相对恒定的，在一定变化值内与试剂和操作批次关系不大，可作为实验室质量是否稳定的指标； 试剂盒中Negative control为阴性质控，High-risk HPV calibrator为阳性标准品。 至少换2~3次手套：换取样器盖子后加裂解液前是第1次（必须），加DR1拍板后是第2次。 取样时，可把“移液器”适当倾斜，以免移液器及其枪头碰到管壁而造成移液器和实验室的污染。 当实验多次不能通过，或是批内批间差异较大时，要多做几个QC2和NC穿插在标本之间，检查是否有较大的偶然误差。出现这种情况，多数是因为实验操作的不规范和偶然因素造成的，要多检查实验操作的细节方面。