五年制碱性磷酸酶的动力学分析解析.pptVIP

碱性磷酸酶的动力学分析 酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。 影响因素包括：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 碱性磷酸酶米氏常数的测定 原理 米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。 在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。 本实验以碱性磷酸酶（AKP）为材料，用磷酸苯二钠为其底物。 AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。 根据红色的深浅可测出酚的含量，进而算出相应的酶活性 (V)。 再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km值。 操作 底物浓度对酶促反应速度的影响 1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)： 加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。 2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。 3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。 酶促反应速度计算 酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg ／15min)来表示。 根据酚标准曲线查出各管的酚含量，