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实验四荧光分光光度法测定维生素B2
实验四 荧光分光光度法测定维生素 B2
一、实验目的
1．了解 F 96 荧光分光光度计的性能及操作。
2．掌握荧光分析法的基本原理。
3．学习荧光分析法测定维生素 B2 的含量。
二、实验原理维生素 B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。其水溶液在 pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为 λex = 465 nm ，最大发射波长为 λem = 520 nm。在低浓度时，λex = 465 nm 时在 520 nm 处测得的荧光强度与维生素 B2 成正比。即：
IFKc
采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素 B2 含量。
当 pH 在11以上时，荧光猝灭。
图 4 维生素 B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）
三、仪器与试剂
1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。
2．试剂：1％HAc 溶液；维生素 B2；复合维生素片剂。
四、实验步骤
1．维生素 B2 标准溶液的配制
称取 10.0 mg 维生素 B2，先溶解于少量 1％HAc中，然后转移至 1L容量瓶中，用 1％HAc至刻度，摇匀，即配制成 10.0 μgmL的维生素 B2 标准溶液。溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。
2．标准系列溶液的配制
取 5个50 mL的容量瓶，分别加入 1.002.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素 B2 标准溶液，用水至刻度，摇匀，待测。
3．未知样品溶液的配制
取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以 1％HAc溶解，转移至 50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。
4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于 F96 荧光分光光度计上发波长测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素 B2 的含量。
五、数据处理
七、思考题
1．结合荧光产生的机理，说明为什么荧光物质的最大发射波长总是大于最大激发波长？
2．为什么测量荧光必须和激发光的方向成直角？
3．根据维生素 B2的结构特点，进一步说明能发生荧光的物质应具有什么样的分子结构？
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