微生物免疫学实验二细菌生长测定.docVIP

目的：測量細菌在液體批次培養(batch culture)中的生長，繪製生長曲線圖並計算生長速率。 ? 原理：測量細菌在液體培養基中的生長速度，必須先測出細菌族群在培養期間不同時間點的密度或數量，再繪圖或以電腦軟體求出族群增長的速率。而測量族群密度常用的方法有三：(1)直接計數法　在顯微鏡下算出固定體積培養液內的細胞數目，由於細菌細胞太小，容易與溶液中的灰塵混淆，此方法大多用於酵母菌、單細胞藻類等較大型的真核微生物；(2)混濁度　利用分光光度計以波長590 - 600 nm的可見光測量細菌培養液的混濁度，通常以OD590表示，其數值在0.9以下時與細菌細胞密度呈直線關係，讀取數值超過0.9時則先做10倍稀釋再測量混濁度，獲得的細菌密度乘以10即得到原本的密度；(3)平盤測定法? 將細菌培養液作連續10倍稀釋後取一定體積塗在平盤培養基上，培養後計算培養基上的菌落數目以推算出原本的細胞密度。第三個方法將在下一次實驗中操作，本次實驗使用第二個方法，為最便利快速而常用的細菌生長測量法。 ? 材料：(每組) i.??????????????????? 含5 ml LB (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%)培養基的白色旋蓋試管 × 6 ii.????????????????? 含5 ml 以NH4+為氮源的葡萄糖低限培養基(glucose minimal medium) (glucose 2%, Na2HPO4 1.3%, KH2PO4 0.3%, NaCl 0.05%, NH4Cl 0.1%)的白色旋蓋試管　× 3 iii.??????????????? 含5 ml 以NO3- 為氮源的葡萄糖低限培養基(glucose minimal medium) (glucose 2%, Na2HPO4 1.3%, KH2PO4 0.3%, NaCl 0.05%, KNO3 0.19%)的白色旋蓋試管 × 3 iv.??????????????? 過夜大腸桿菌培養液(培養在以NH4Cl為氮源的葡萄糖低限培養基中) × 1 v.????????????????? 無菌水 100 ml? × 1 vi.??????????????? 空懸蓋試管4支 vii.????????????? P1000微量吸管一支、1000 ml微量吸管尖ㄧ盒、標籤紙8個、透明膠帶、小燒杯一個 ? 全班：分光光度計 ? 步驟： 1.????? 在裝有LB培養液的四支試管蓋上貼上標籤，註明組別，並分別標示為A、B、C與D。 2.????? 將分光光度計電源打開並暖機10分鐘。依照使用說明將光度計歸零，將波長定為590 nm。 3.????? 以微量吸管吸取100 ?l細菌培養液，加入四支試管中。 4.????? 將含有新鮮培養液的試管插入分光光度計中歸零之後，將已接種細菌的試管插入，加蓋後讀出培養液的OD值並作紀錄，OD值若未達0.1可再多加一點菌液，但每一支試管應加入相同體積菌液。 5.????? 將A、B兩支試管管蓋轉鬆，以膠帶固定以防脫落，C、D試管的管蓋旋緊後，插在旋轉培養器上對稱的位置，將培養器電源打開，轉速設在約150 rpm，在室溫進行培養。 6.????? 在兩支以NH4Cl為氮源的葡萄糖低限培養基試管上貼上標籤，註明組別並標示為E和F，在兩支以KNO3為氮源的葡萄糖低限培養基試管上貼上標籤，註明組別並標示為G和H。 7.????? 如步驟3和4的描述將細菌接種到E、F、G、H試管內，並紀錄初始的OD值。 8.????? 將四支試管管蓋轉鬆，以膠帶固定以防脫落，插在旋轉培養器上對稱的位置，將培養器電源打開，轉速設在約150 rpm，在室溫進行培養。 9.????? 每隔約20-30分鐘取下試管，依步驟4讀取各試管培養液OD值並確實紀錄讀取數值及讀取時間。操作時不要讓旋轉培養器暫停時間過長，取下試管後立刻再開啟培養器電源，以免影響旋轉培養器上其他試管內的生長速率。測量後立刻將試管放回培養器上繼續培養。 10.? 將所紀錄的時間與OD值作圖，以時間為橫軸，log(OD590)為縱軸，菌液進入log phase後的各點應落在一直線上，連續測量至三個(含)以上的測量值成一直線，利用此直線找出細菌生長的加倍時間(doubling time)與平均生長速率(mean growth rate constant)。 11.? OD590超過0.9以上時細胞密度與log(OD590)值不再成直線關係，因此須先以微量吸管吸取培養液0.5 ml，加4.5 ml培養液稀釋10倍，取得OD值後再乘以10以求得正確的混濁度。 ? ? ? 結果與討論 OD600測量值 時間 ? ? 分鐘 ? ? 分鐘 ? ? 分鐘 ? ? 分鐘 ? ? 分