总可溶性酚和木质素含量的测定.docVIP

总可溶性酚和木质素含量的测定 80%甲醇② 1 N Folin-酚试剂（Folin and Ciocalteaus Phenol reagent) 1 mol/L Na2CO3：称取105.99 g Na2CO3，蒸馏水溶解并定容至1000 mL ④ 邻苯二酚2 N HCl：83.3 mL浓HCl⑥ 1:10比例的巯基乙酸和2 N HCl混合液：30 mL巯基乙，溶于300 mL 2 N HCl 0.5 N NaOH：20.0 g NaOH，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL ⑧ 浓HCl酚类物质含量测定：分别在接种前(0 h)和接种后的1、3、5、7 d采集水稻的第3、4片叶，在-80℃下保存备用，用以测定总可溶性酚和木质素的含量。参照Rodrigues等（2005）的方法。0.1 g加入液氮研成粉末，转移到中，加入1.5 mL的80%甲醇用包裹Ependorf管，防止光氧化，在25℃下，用150 rpm振荡过夜。提取物在下离心10 min，上清液转移到中，在-20℃下保存，用于总可溶性酚含量的测定。沉淀在-20℃下保存，用于木质素含量的测定。 ⑴ 总可溶性酚含量的测定参考Folin-Ciocaileu比色法 取上清液（甲醇提取物）150 μL，加入150 μL N Folin-酚试剂（Folin and Ciocalteus Phenol reagent)，摇匀，室温下保持5 min。接着加入 μL的1 mol/L Na2CO3溶液，摇匀，在室温下保持10 min。向混合物加入1 mL双蒸水，摇匀室温下保持1 h混合物在725 nm下比色，测定吸光度。用邻苯二酚做标准，单位为μg·g-1 W（或mg·kg-1 FW）。 反应体系（总体积1.50 mL） 甲醇提取物150 μL 1 N Folin-酚试剂150 μL 摇匀，室温下保持5 min1 mol/L Na2CO3 200 μL 摇匀，室温下保持10 min1 mL 室温下保持1 h 725 nm(或765 nm)比色μg/mL邻苯二酚标准液。 管号 1 2 3 4 5 6 邻苯二酚标准液(mL) 0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.30 1 N Folin-酚试剂 150 μL摇匀，室温下保持5 min 1 mol/L Na2CO3 200 μL，摇匀，室温下保持 min dd H2O 1.15 1.12 1.09 1.06 1.03 1 0.85 室温下保持1 h725 nm(或765 nm)处比色 总体积1.50 mL 邻苯二酚终浓度μg/mL) 0 1 2 3 4 5 10 ⑵ 木质素含量的测定 向提取总可溶性酚得到的沉淀加入1.5 mL双蒸水，涡旋摇匀，在离心力为12, 000 g下离心5 min，丢弃上清液，将沉淀在65℃ 下干燥过夜。将1.5 mL的1:10比例的巯基乙酸和2 N HCl混合液加入到干燥的沉淀中。轻轻摇匀，沸水浴4 h后，立即置于冰水中冷却，4℃下保持10 min。混合物在离心力为12, 000 g下离心10 min，丢弃上清液。沉淀用1.5 mL双蒸水冲洗，接着在离心力为10,000 g下离心10 min，离心后丢弃上清液。沉淀用1.5 mL的0.5 N NaOH溶液重新悬浮，混合物在室温下用摇床(150 rpm)振荡过夜。混合物在离心力为10,000 g下离心10 min，上清液转移到新的Ependorfg管中。向上清液加入200 μL浓HCl，将Ependorf管在4℃下保持4h，使木质素-巯基乙酸衍生物（LTGA）充分沉淀。接着在离心力为10,000 g下离心10 min，丢弃上清液，用2 mL 0.5 N NaOH溶解橙棕色沉淀。在280 nm下测定溶液吸光度，用木质素标准品(Lignin alkali 2-hydroxypropyl ether)（Sigma-Aldrich, USA）作标准曲线，浓度单位用mg·kg-1 W表示。