质粒DNA提取-琼脂糖凝胶电泳-lxz.pptxVIP

实验一、质粒DNA提取;质粒（plasmid）：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 细菌质粒：是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。???????????????? ?质粒与宿主的关系：? ?质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质胞则不能存活。?????而宿主即使没有它们也可以正常存活。?????质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。?? ?;质粒在细胞内的复制一般有两种类型:? ? 紧密控制型(Stringent?control)：? ?只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。?质粒在细胞内的复制一般有两种类型:? ? 松驰控制型(Relaxed?control)?：? ?????在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col?E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。??? ;质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。?? ?与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)??? ?一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,??? 去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作 要求：多个酶切位点 对受体细胞没有危害并易于分离 能自我复制并稳定保存 具有特殊的标记基因;目的： 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术? 实验原理：? 碱裂解法提取质粒 是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。? ;;实验二、琼脂糖凝胶电泳;实验原理 琼脂糖：来于琼脂，线性多聚物 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。;影响核酸分子泳动率的因素： 1、DNA分子大小；DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 2、琼脂糖浓度；反向关系 3、DNA构象；不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 4、所用的电压；正向关系 5、电泳缓冲液： TAE，TBE，没有离子时DNA不泳动。;琼脂糖电泳的优点： 1.操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理 2.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，电泳图谱清晰，分辨率高 3.琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接紫外检测及定量 4.易染色;步骤如下： ? 1.?胶板制备: 2.?制备1%琼脂糖凝胶：冷却到65℃左右加DNA染料（EB或替代物），混匀，小心地倒入内槽玻璃板上.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,.添加?0.5×TBE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止.? ?3.?加样:与上样缓冲液混合,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X. ?4.?电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.? ?(5)电泳完毕后,取出凝胶,在紫外灯下