实验二离子柱层析法分离氨基酸.docVIP

课程名称 生物制药技术 项目/主题 离子交换柱层析法分离氨基酸 课 类 实验 课 序 周二5-8 学时 4 班级/小组 09生物制药3班 地 点 实验楼212 时间 2010-11-2下午 教学 目的 学会装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术 能力（技能）目标 知识目标 熟悉装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术 掌握离子交换剂的化学本质和洗脱原理 重点 难点 与 解决 方案 难点重点：离子交换剂的化学本质和洗脱原理 解决方案：讲授、板书，示范操作、演示、巡回答疑 参考 资料与 媒体 , /listw.asp? 教学 条件 演示 教学 小结 经过演示后大部分同学做得比较成功 教师 签名 陈辉芳 检查者 签名 检查 日期 单元（节）教学设计首页 第 2 单元（1节） 单元（节）教学设计页 第 2 单元（1节） 步骤 教学内容 方法手段 学生活动 时间分配 实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的层析技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和一定离子强度的电解质溶液。 离子交换剂是具有酸性或碱性基团的不溶性高分子化合物，这些带电荷的酸性或碱性基团与其母体以共价键相连，这些基团所吸引的阳离子或阴离子可以与水溶液中的阳离子或阴离子进行可逆的交换。因此根据可交换离子的性质将离子交换剂分为两大类：阳离子交换剂和阴离子交换剂。 据离子交换剂的化学本质，可将其分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换葡聚糖等多种。 树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合。改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离，由于不同的氨基酸在不同的pH值及离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后顺序洗出，达到分离的目的。 提问： 为什么离子交换柱层析能名分离氨基酸？ 凝胶柱层析与离子交换柱层析的异同：在原理上都是相通的，区别在于流动相和层析剂之间的作用力的不同。离子交换是利用蛋白质表面的电荷与层析剂上的离子基团的静电作用。凝胶过滤层析利用了凝胶的多孔性，根据溶剂分子的大小进行分离。 讲授 学生思考，回答问题 25min 5min 单元（节）教学设计页 第 2 单元（1节） 步骤 教学内容 方法手段 学生活动 时间分配 2 3 二、实验过程 1、演示： 层析柱的准备：将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性．搅拌一小时后装成一个直径1cm．高?16～18?cm的层析柱。 2、氨基酸的洗脱：用P?H5.8的柠檬酸缓冲液流洗平衡交换住（装置如图）。调节流速为0.5mL／min，流出液达床体积的4倍时即可上样。由柱上端仔细加人氨基酸混合液0．25—0．5mL，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL拧檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时。再加入0．5mL缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面），并将柱与洗脱瓶和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收集lmL．共收集20-40管。 3、氨基酸的鉴定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中淮确加热15分钟后冷却至室温．再加1.5mL的50％乙醇液。放置10分钟。以收集液第2管为空白，测定A570nm波长的光吸收值。以光吸收值为纵坐标，以柱洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。以已知2种氨基酸的纯溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照．可确定3个峰的大致位置及各蜂为何种氨基酸。 学生操作 1．树脂的处理 干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol／L HCl及2mol／L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用lmol／L，NaOH浸半小时(转型)，用蒸馏水洗至中性。 2．装柱 垂直装好层析柱，关闭出口，加入柠檬酸缓冲液约1cm高。将处理好的树脂加等体积缓冲液，搅匀，沿管内壁缓慢加入，柱底沉积约lcm高时，缓慢打开出口，继续加入树脂直至树脂沉积约10cm高。装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则需重新装柱。 3．平衡 将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3～4cm左右的液层，开动恒流泵，以0.4 ml/min的流速平衡，直至流出液pH与洗脱液pH相同(约需4倍柱床体积)。 演示 巡回 指导 观看 操作 30 150