生物转化常见反应类型.pptVIP

转化方法 相似于静息细胞法。 不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有葡萄糖一类能源的物质即可。 通常转化时使用的孢子浓度为108－109个/ml. 转化pH一般为5-6 原生质体试验法 方法 通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去细胞壁，获得原生质体。 将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加前体物质，进行喂养试验，观察结果。 原生质体试验法特点 排除了细胞壁通透性障碍。 保全了整体细胞的内酶系统。 避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏了酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应（氧化还原反应）不能进行的缺点。 遗传特性诱变法 菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是研究生物转化过程中，产物形成的遗传机制的一种有效方法。 将转化菌进行诱变，使其失去转化底物或形成某个中间体的能力，从而就可分离到生物转化中的各种不同的障碍突变株，即负突变株。这种负突变株能够积累某种代谢产物或支路代谢产物。从分析转化菌和突变株的代谢产物化学结构上的 差异，找出这些代谢产物在合成中的相互关系，从而可推断生物转化的反应步骤。 同位素示踪法 同位素示踪法是研究生物转化的好方法。即应用同位素转化的起始物和中间体进行喂养试验，由于试验菌没有区别标记化合物及非标记化合物的能力，因此标记化合物和非标记化合物一样，都能参与菌体的代谢变化，然后通过测定产物或中间体的同位素含量及分布情况，从而判断试验化合物是否参与生物转化。 缺点 为了确定同位素的结合位置，必须将产物进行一系列的化学降解、分离和测定等大量工作。 近年研究概况 近年来，利用没有放射性的稳定同位素13C、2H、15N、18O等来作示踪研究，特别是13C，可应用碳核磁共振仪来直接测定该生物转化产物中间体的碳核磁共振谱，从核磁共振谱的解析中，便可知道该示踪原子被结合到产物或中间体的分子结构中的位置和分布情况。 由于这项工作可在实验室完成，不仅简化了大量的化学降解和分析测定步骤，而且保证工作人员的健康和推进研究工作的进展。 选择性边链降解问题 选择性边链降解策略（3） 辅助基因工程 提高边链降解的产率策略 选择性甾体边链降解措施1 对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解 例如：1965 Sih等 将胆固醇先行改造为19羟基衍生物 再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。 选择性甾体边链降解措施2 加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C 1，2脱氢酶和9?羟化酶。 如： Ni Co Pb Se 8－羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解 金属鳌合剂 2，2－双联吡啶 抑制母核降解 选择性甾体边链降解措施3 对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株 例如： 原始菌株经诱变为 诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制剂，便产生雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD） 再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 无C 1，2脱氢酶 能产生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD） 基因工程新技术的应用 专利： Pseudomonas 菌株无降解甾体的能力 将Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA导入Pseudomonas 菌株中获得重组菌。 重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。 Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快 结果加快转化进程，降低成本。 方法 分离纯化Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA 整合到特定质粒载体中 导入?噬菌体中 用入?噬菌体感染E.coli HB101，得E.coli重组子 三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得转移。 如何提高甾体边链降解的产率 接触 提高甾体边链降解速率 Hesselink等研究表明：环糊精能明显增强Mycobacterium sp NRRL-3683 降解胆固醇、谷甾醇等边链生成AD的产率，不影响细胞生长速度和细胞密度。 当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解边链的活性可增加1.7-3.0倍。 环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑制。 环糊精在甾体边链降解中的作用总结 在甾体边链降解过程中，环糊精充当： 惰性甾体增溶剂 反应载体 保护剂 甾体边链降的成功应用 Arhna 和Sih等研究报道以胆甾醇和?－谷甾醇为原料微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。 采用酶抑制剂 生化阻断变株 改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而选择性控制