土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-上课用.pptVIP

课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 细菌脲酶 一、课题背景 （一）筛选菌株KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。 （一）筛选菌株1、选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 2、菌株： 纯且活状态所保存的菌种 。 （二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理： 1个菌落→1个活菌 （3）统计原则 ①选 30～300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值 （二）统计菌落数目 1、活菌计数法 （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。 2、显微镜直接计数 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。 设置对照—同等条件下，培养空白培养基 （三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。 四、实验过程 （一）土壤取样? （1）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70～90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3～8cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。 菌落计数 配制土壤溶液 系列稀释 涂布平板与培养 （二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30～300之间。 （三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：30～37℃，1～2d; 放线菌:25～28℃, 5～7d; 霉菌: 25～28℃, 3～4d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象 　　 (1)对样品进行系列稀释 (2)用适当的稀释液涂布平板 在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。 （四）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 * *