实验2 蛋白质的分离纯化.pptVIP

蛋白质的分离纯化 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 实验二 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 阳离子交换剂 电荷基团 反离子 阴离子交换剂 电荷基团 反离子 基质 基质 — ＋ — ＋ — ＋ 溶液中的离子 或离子化合物 溶液中的离子 或离子化合物 可逆交换 可逆交换 ＋ — 2、酶活性检测 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 实验操作方法和步骤 1、离子交换剂准备：(实验室已准备好） DEAE-Sepharose Fast Flow ， 取适量DEAE-Sepharose Fast Flow ，加入0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用布氏漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。 2、样品处理： 将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃ 12000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。 3、纯化检测仪器连接： 将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒流泵 (10rpm) （流速0.2～0.6 ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（3～4 ml/管）等按下图连接并设置好。 2 1 1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液 2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 梯度混合器 层析柱（φ1.0×20㎝ ） 恒流泵 核酸蛋白检测仪 记录仪 部分收集器 DEAE- Sepharose Fast Flow 纯化检测仪器连接示意图 4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡 ： 装柱前将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待柱内DEAE-Sepharose Fast Flow 凝胶沉降并分出水层后，吸去水层，再补加处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶；待凝胶自然沉积30 min 后松开层析柱出口，调节流速 1ml/3min；直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流