云南省6株C群脑膜炎奈瑟菌分子生物学特征分析.docVIP

云南省6株C群脑膜炎奈瑟菌分子生物学特征分析 　　　　　　　 了解云南省分离出的C群脑膜炎奈瑟菌的分子特征。方法 对C群菌株进行脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）、多位点测序技术（MLST）分型。结果 对６株C群脑膜炎奈瑟菌进行脉冲场凝胶电泳,发现６种带型；6株C群做了MLST分型，分属5种，有4种MLST在当时的数据库中未找。结论 云南省C群脑膜炎奈瑟菌的基因具有高度多样性，且没有典型的流行菌群。 流行性脑脊髓膜炎(流脑)是由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides Nm)感染人体后引起的急性呼吸道传染病。该病传染性强,人群中隐性感染多。脑膜炎奈瑟菌的分子生物学分型方法包括脉冲场凝胶电泳( pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、多位点 测序分型(multi locus sequence typing ,MLST) ,核糖体分型 (ribotyping)等。云南引起流行致病的多为A群，B、C群引起致病少见。2005年以前云南省健康人群带菌情况调查中，以A 、B群为主，卫发现C群菌株[1~2]。但2005年C群曾引起我国部分省市流脑暴发或流行[3] ，因此对2006年C群脑膜炎奈瑟菌进行了分子生物学研究，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 选择2006年云南省健康人群带菌情况调查中分离到的6株C群脑膜炎奈瑟菌，其中2株分离自昭通、3株分离自德宏，1株分离自红河。经过实验室用血清凝集、乳胶凝集检验确认为C群脑膜炎奈瑟菌。 1.2仪器 测定培养细菌浓度(A值)的光度计为bioMerieux Vitek　Colorimeter，脉冲场凝胶电泳仪为Bio－Rad CHEF－DRⅡ系统,凝胶成像仪为Bio－Rad Gel Doc XR系统，PCR扩增仪为MJ公司的PTC200。 1.3主要试剂 一次性巧克力琼脂培养基（天津市金章科技发展有限公司）、血清：Agglutinating serum Neisseria meningitides Group A 、B 、C、 D 、Y 、W135(Remel Europe Manufactured Ltd)、 脑膜炎奈瑟菌诊断血清 (中国疾病预防控制中心传染病所)、乳胶试剂：Slidex meningite-kit-5 ( Biomerieux sa)、琼脂糖SeaKem　Gold　Agarose(Bio-rad公司)、限制性内切酶NheⅠ(大连宝生物公司)、蛋白酶K(MERCK公司产品)，细菌基因组DNA试剂盒（北京赛百盛公司），PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒（大连宝生物公司），管家基因引物参照/neisseria，均由大连宝生物公司合成。 1.4方法 1.4.1血清学及乳胶凝集试验　　细菌血清学结果为多价Ⅰ+ 、多价Ⅱ- 、多价Ⅲ- 、A 群-、B群- 、C 群+、盐水凝集- 。采用乳胶凝集法进行确认实验, 此6 株菌均与乳胶凝集试剂C群凝集, 与A群、B群乳胶试剂均不发生凝集。 1.4.2脉冲场凝胶电泳　参考Bygraves, Maiden[4]的方法进行PFGE 分型。 1.4.２.1DNA制备 取新鲜培养物集菌于2ml细胞悬浊液中, 调整至4麦氏单位。取菌悬液37℃放置, 分别加入蛋白酶K, 加入l%SeaKem　Gold,制成胶块于室温下凝固后。把胶块放入试管中,加入蛋白酶K细胞裂解液混合液,54℃水浴轻摇2h,弃溶液,用50℃预热的灭菌纯水、TE分别洗胶块。 酶切 切取2mm宽的胶块加入酶切缓冲液中, 再加入NheⅠ37℃酶切2h。用同样的方法处理标准株H9812的胶块(用XbaI 酶切) 。 电泳　将酶切后的样品胶置于样品梳上,摆放到模具上。将已融化好1％琼脂糖倒入制胶槽中，待凝固后放入电泳仪中。电泳条件：电泳时泵设为70, 电泳温度14℃, 电压6V, 夹角120°, 脉冲时2～10s, 电泳13 h, 然后脉冲20～25 s, 电泳6h。电泳后的胶块用EB染色30min，再用纯水清洗, 凝胶成像仪上拍摄图像。 图像分析及结果聚类 用Bionumerisc V4.0 软件对数据进行聚类分析,方法采用UPGMA。 1.4.3多位点序列分析(MLST) 提取细菌基因组DNA 按照硅胶膜DNA提取试剂盒说明书严格操作，提取的基因组-20℃保存待用。 PCR扩增DNA 片段 Nm菌的７对管家基因abcZ 、adk 、aroE 、fumC 、gdh 、pdhC 、pgm ,参照/neisseria公布的标准方案进行。 管家基因位点的测序和比对 由大连宝生物公司完成。管家基因测序结果与数据库/neisseria进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，提交MLST网站,确定脑膜炎奈