分子生物学与细胞生物学实验基本技术1.docVIP

实验三 细胞传代 一、目的 学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。 二、概述 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。 三、材料 （一）仪器 净化工作台 离心机 恒温水浴箱 冰箱（4℃、-20℃） 倒置相差显微镜 培养箱 （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头） 玻璃瓶（250ml、100ml） 培养瓶 废液缸 塑料器皿 吸头 枪头 胶塞 15ml离心管 EP管 （四）其他物品 微量加样枪 红血球计数板 （五）试剂 D-Hanks液 小牛血清 RPMI1640 双抗（青霉素、链霉素） 胰蛋白酶（0.08%）或EDTA或两者混合液 1NHCl 4%NaHCO3 四、操作步骤 贴壁细胞的消化法传代： 吸除或倒掉瓶内旧培养液。 D-Hanks液洗2～3次。 向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。 消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。 吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。 计数，分别接种在新的培养瓶内。 悬浮细胞的传代 悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。 离心传代法： 将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内； 离心800～1000rpm，5min； 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液； 计数，分别接种在新的培养瓶内。 直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。 (三)、部分贴壁细胞的传代 部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。 五、注意事项 胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。 离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。 要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。 审 实验四 细胞冻存和复苏 一、目的 学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。 二、概述 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 三、材料 （一）仪器 净化工作台 离心机 恒温水浴箱 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 倒置相差显微镜 培养箱 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头） 培养瓶 玻璃瓶（250ml、100ml） 废液缸 （三）塑料器皿 吸头 枪头 胶塞 移液管（10ml） 15ml离心管 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 微量加样枪 红血球计数板 记号笔 医用橡皮膏 移液枪 （五）试剂 D-Hanks液 小牛血清 培养液 双抗（青霉素、链霉素） 胰蛋白酶（0.08%） 1NHCl 7.4%NaHCO3 DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 离心1000rpm，5min； 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液