硝酸酶实验报告.docxVIP

（辣椒，番茄）植物体内硝酸还原酶活力的测定 生命科学学院 11级伯苓班 1111023 史忠 [摘要]本实验利用离体法测定了辣椒和番茄叶片的硝酸还原酶活性，结果表明诱导组硝酸还原酶活力明显高于非诱导组，说明硝酸还原酶是一种诱导酶，它在硝酸盐的诱导下产生。 [关键词]硝酸还原酶，离体法，辣椒，番茄 1前言 植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化态。硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。所谓诱导酶，是指植物体本来不含有，但在特定外来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶。硝酸还原酶是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。 2 材料与方法 2.1 实验材料 新鲜辣椒和番茄叶片，诱导组材料为补加过硝酸钾溶液的培养基中生长的植物叶片；对照组未补加硝酸钾溶液。. 2.2 实验方法 实验材料的预备 先在六个培养缸里每个加入600毫升蒸馏水； 然后按照下表分别加入各种成分并做好标记； 接着把辣椒和番茄的幼苗接种到每个缸中； 第二天又在每个组的2号缸中加入6毫升KNO3溶液， 1号缸什么都不加； 第三天， 我们取这些植物叶片分别进行硝酸酶活力的测定 KH2PO4MgSO4KClCaCl2(NH4)2SO4KNO3EDTA-Fe微量元素A-1222321A-2222321B-12223321B-22223321C-12223621C-22223621注：表中单位均为毫升 标准曲线制作 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.20μg/mL的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度（μg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（r）建立回归方程。 管号1234567试剂 取量mL亚硝酸钠标准液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.401% 磺胺44444440.2%萘基乙烯胺 4444444每管亚硝态氮浓度μg/mL00.020.040.080.120.160.20吸光值00.030.0720.1560.2350.3230.399 酶的提取：称取0.5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液4 mL，4℃ 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。 酶反应：取4个10 mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25℃保温30min。 酶反应管 粗酶液/mL0.1mol/LKN磷酸缓冲溶液/mLNADH溶液/mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲溶液/mL非诱导-对照1.01.600.2非诱导-实验1.01.60.20诱导-对照1.01.600.2诱导-实验1.01.60.20 终止反应和比色测定：30min后立即加入lmL磺胺溶液终止酶反应，再加l mL萘基乙烯胺溶液，显色30min后过滤，所得滤液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（μg/mL ）。 2.3 计算方法 样品中酶活性（μg ·g-1·h-1）=X*V3/(V1*V2)/(W*t) X ——反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（μg/mL）； V1——提取酶时加入的提取缓冲液体积（mL）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（mL）； V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； W ——样品质量（g）； t ——反应时间（h）。 材料 吸光度番茄叶片辣椒叶片A1A2B1B2C1C2A1A2B1B2C1C2对照组1为参比0.0020.013-0.02-0.07-0.0120.0140.0090.031-0.0130.0810.0520.020对照组2为参比0.015-0.0250.0100.0230.00-0.002亚硝态氮浓度0.00100.00650.007500.0050